固相萃取/定量核磁共振波譜法測定乳增寧膠囊中的淫羊藿苷

劉曉婷，李苗苗，肖 坤，郭強勝，許 旭

(上海應用技術大學 化學與環境工程學院，上海 201418)

定量核磁共振波譜法(qNMR)相比于HPLC、GC-MS、LC-MS，具有無需待測物的高純標準品等優勢[1-2]。該法根據不同化學環境下質子NMR峰面積正比于質子數進行定量分析[3]，是解決無標樣定量分析問題的重要途徑。近年來qNMR方法被廣泛用于中藥[4-7]、化學藥[8-9]、食品[10]和代謝組學[11-13]等的研究。中國藥典于2010版開始將該技術作為法定標準收載于通則(附錄)中[14-15]。

乳增寧由艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、土貝母等多種中藥組成[16],淫羊藿苷(Icariin)是處方中淫羊藿的主要活性成分[17-18]。近年來，對乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的測定已有不少研究，謝東等[19]將樣品超聲提取后采用柱層析和紫外法分析，汪濤等[20]、張玉婷等[21]超聲提取后分別建立HPLC方法進行定量分析。但中藥制劑成分復雜，樣品中的強保留物對HPLC法柱子損傷較大[22]。李瑋玲、李瑾翡等[23-24]分別使用固相萃取(SPE)后再用HPLC分析樣品中的淫羊藿苷；干劍欽等[25]將腎寶合劑樣品提取后用SPE柱處理后，用HPLC法分析其中的淫羊藿苷。這些HPLC方法在測定時均需要淫羊藿苷標樣。

qNMR方法無需待測物的高純標準品，只需常用的幾種內標和氘代試劑即可完成定量分析[1]，是常用中藥分析方法的重要補充。但用于低含量成分分析時會存在靈敏度和干擾等問題。禹珊等[26]將兩次丙酮提取后的樣品水浴旋干后溶于少量氘代試劑，通過提高濃度來改善靈敏度。Yang等[7]使用氘代三氟乙酸使原本互相干擾的定量峰分離。

固相萃取(SPE)作為一種方便有效的樣品前處理方法，具有凈化樣品和富集濃縮待測組分等功能。將SPE與qNMR結合，可以有效地解決qNMR的靈敏度和干擾問題。已有一些文獻直接采用SPE/qNMR方法測定樣品，如van der Hooft等[27]將尿液樣品過HLB型SPE柱，4 mL甲醇洗脫后采用HPLC-TOF MS-SPE/NMR(1H NMR、2D-NMR)等對飲茶后人體尿液樣品中的代謝物進行直接定性定量分析。Wagner等[28]使用SPE/qNMR分析污染工業廢水中的原油和正己烷。Godejohann等[29]將SPE結合HPLC-UV與1H NMR對污染物進行了定量分析。但目前對SPE/qNMR聯用方法進行系統研究、并做方法驗證的文獻報道不多。Pieri等[30]將樣品提取物用C18型SPE柱凈化富集，以dDMSO洗脫后用qNMR內標法測定了朝鮮薊葉提取物中的萊薊苦素。Moura[31]等將加入內標的樣品溶液用C18型SPE進行富集凈化后用qNMR測定了環境和生物樣品中的β-N-甲基氨基-L-丙氨酸，并做了方法驗證。Li等[32]將收集的42種黨參樣品提取后采用C18型SPE柱處理，用qNMR測定了4種生物堿。本課題組采用MCX型SPE柱結合qNMR定量測定了板藍根飲片中的表告依春，并對重復性、精密度、線性、回收率等作了方法驗證[33]。

本實驗將SPE與qNMR結合，以乳增寧膠囊為樣品，用SPE凈化樣品并富集濃縮待測組分含量，建立了SPE/qNMR測定乳增寧膠囊中有效成分淫羊藿苷含量的方法。對所建立方法的精密度、線性范圍、靈敏度、回收率等進行了驗證。本實驗無需對照品即可實現對乳增寧膠囊中淫羊藿苷的定量測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ 500MHz核磁共振譜儀(德國Bruker公司)；U-3000高效液相色譜儀(Thermo-Fisher公司)；M2p高精密天平(精度0.001 mg，德國Startoriu公司)；AB204-N精密天平(精度0.1 mg，上海世義精密儀器有限公司)；VGT-2120QT超聲波清洗儀(廣東固特超聲實業有限公司)；800B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；DC-12氮吹儀(上海安譜科學儀器有限公司)。CNWBOND HC-C18固相萃取柱(2 g，10 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司)；Innoval Neo XD高效液相色譜C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，Agela Technologies)。

淫羊藿苷(Icariin，中國廣州分析測試中心科力技術開發公司)；2,3,5-三碘苯甲酸(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(基準物質，99.95%～100.05%，上海泰坦科技股份有限公司)；氘代二甲基亞砜(d6-DMSO，99.9%D，Cambridge Isotope Lab.Inc.)；甲醇(HPLC級，阿達瑪斯試劑有限公司)；乙腈、乙醇為國產分析純。實驗室用水為屈臣氏蒸餾水。乳增寧膠囊樣品1(蚌埠豐原涂山制藥有限公司，批號：161104)；樣品2(修正藥業集團長春高新制藥有限公司，批號：160901)；樣品3(蚌埠豐原涂山制藥有限公司，批號：161024)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品處理精密稱取乳增寧膠囊內容物0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入10%乙醇10 mL，稱重，超聲提取40 min，取出放冷后再稱重，加10%乙醇補充損失的質量。4 000 r/min離心5 min后，收集上層清液，過濾除去初濾液，收集續濾液。

依次用10 mL甲醇和10 mL水活化CNWBOND HC-C18SPE固相萃取柱(2 g，10 mL)。將6 mL上述續濾液過柱，加壓控制流速大約為3秒/滴。之后用2 mL水對柱子進行淋洗。依次用2 mL乙腈和2 mL 45%乙腈進行洗脫。洗脫液用氮氣吹至0.1 mL，加入0.4 mL氘代DMSO，再加入精密稱取的2,3,5-三碘苯甲酸作為內標，混合均勻后轉移至核磁管中。

1.2.2HPLC檢測條件參考2015版中國藥典[16]以及相關文獻[25]，選擇用于考察SPE操作方法的HPLC檢測條件為：Innoval Neo XD C18色譜柱(150 mm×4.6 mm)，流動相甲醇-水(60∶40，體積比)；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫35 ℃，檢測波長270 nm。

1.2.3核磁共振定量核磁共振(NMR)采集條件：脈沖寬度P1=14.1 μs，延遲時間d1=1 s，掃描次數NS=256，譜寬SW=20 ppm，中心頻率O1=3 090 Hz，采樣時間AQ=3.17 s，于室溫下測得核磁共振圖譜。用Topspin軟件將定量峰處的基線調平，然后選擇相應質子峰的積分區間，將每個峰積分3～5次，當RSD < 1%時取平均值。采用2010版中國藥典定量核磁共振技術的絕對定量公式(1)計算淫羊藿苷的含量[14-15]：

Ws=Wr×(As/Ar)×(Es/Er)

(1)

式中，Wr為內標物的質量，Es為供試品的質子當量重量(分子量除以特征峰的質子數)，Er為內標物的質子當量重量，As為供試品的峰面積，Ar為內標峰的峰面積。

2 結果與討論

2.1 樣品制備方法的選擇

2.1.1樣品提取條件的優化乳增寧中淫羊藿苷的提取方法以超聲波提取為主[19-21]，本實驗用“1.2.2”的HPLC檢測條件考察了提取次數影響。稱取乳增寧膠囊內容物0.25 g，按“1.2.1”對樣品進行前處理后，檢測續濾液。結果顯示，第2次超聲后續濾液中淫羊藿苷的峰面積僅為第1次提取的1/70。因此本實驗選擇1次超聲提取。

中國藥典中對淫羊藿苷采用超聲提取(功率360 W，頻率50 kHz) 40 min[16]。本實驗超聲儀器功率為400 W，根據藥典分別考察超聲提取10、20、30、40、50、60 min對淫羊藿苷提取效果的影響。根據峰面積估計淫羊藿苷的含量。結果顯示，超聲40 min時，直接HPLC測定的淫羊藿苷峰面積較大，繼續增加時間響應值(峰面積)差異不大。故選擇超聲時間為40 min。

綜合以上實驗，最終選擇乳增寧膠囊中淫羊藿苷的提取方法為：40 min超聲提取1次。棄去前2 mL初濾液，取續濾液6 mL過固相萃取小柱。

2.1.2固相萃取條件的選擇優化了SPE柱的類型及其活化、樣品溶劑類型、上樣量、柱淋洗劑的類型、柱洗脫劑的類型、洗脫劑用量7個條件，以選擇合適的固相萃取條件。

SPE柱及其活化：文獻中[23-25]多采用C18柱純化淫羊藿苷，本實驗使用C18柱也取得了較好的效果，因此選擇C18柱。通過比較，選擇用10 mL甲醇與10 mL水活化平衡C18固相萃取柱。

樣品溶劑的選擇：考察了30%乙腈、60%甲醇、水、5%乙醇、10%乙醇、70%乙醇6種溶劑溶解乳增寧膠囊內容物時對淫羊藿苷的保留效果。結果顯示，用30%乙腈、60%甲醇、70%乙醇作為樣品溶劑進行上樣時均有大量的淫羊藿苷漏下。用水、5%乙醇與10%乙醇作為溶劑上樣時對淫羊藿苷的保留效果最好，但由于水與5%乙醇對于乳增寧中淫羊藿苷的提取率比10%乙醇差，所以實驗選用10%乙醇。

上樣量：將8 mL續濾液過柱，分別接第2、4、6、8 mL流出液進行檢測，前6 mL淫羊藿苷均能夠很好地保留在柱上，后2 mL會有少量淫羊藿苷漏出，所以最終選擇上樣量為6 mL。

淋洗劑：選擇2 mL水進行淋洗，并將流出液收集進行檢測，均未檢測到淫羊藿苷。

洗脫劑：考察了用甲醇、乙腈、45%乙腈洗脫淫羊藿苷和后續吹干的效果，發現用相同體積的甲醇或乙腈不能完全洗脫淫羊藿苷，最終選擇用乙腈與45%的乙腈相結合的方法進行洗脫。

洗脫劑用量：先用乙腈2 mL洗脫，然后用45%乙腈4 mL分2次，每次2 mL繼續洗脫，收集洗脫液，并對洗脫液進行檢測。結果顯示，第5～6 mL洗脫液中淫羊藿苷的峰面積大約為第1～2 mL洗脫液的0.3%，因此本實驗選擇的洗脫劑用量為乙腈和45%乙腈各2 mL。

綜上所述，固相萃取的最終條件為：活化：10 mL甲醇、10 mL水；上樣：6 mL 10%乙醇；淋洗：2 mL水；洗脫：2 mL乙腈，2 mL 45%乙腈。

2.2 氘代試劑的選擇

將得到的4 mL洗脫液氮氣吹干后用不同的氘代溶劑溶解，氘代DMSO能很好地溶解產物，并對定量峰無干擾，因此實驗選擇氘代DMSO作為溶劑。

2.3 內標物的選擇

考察了幾種常用的內標物(鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸和2,3,5-三碘苯甲酸)的效果，其中前兩者的NMR峰均會與樣品NMR峰有重疊，而2,3,5-三碘苯甲酸與樣品組分互相不干擾，因此選擇2,3,5-三碘苯甲酸作為內標物。

2.4 信號歸屬及定量峰的確認

圖1 淫羊藿苷標液與內標2,3,5-三碘苯甲酸的1H NMR譜圖Fig.1 NMR spectra of icariin standard and 2,3, 5-triiodobenzoate internal standardA.icariin；B.2,3,5-triiodobenzoate；C.the mixture of A and B

圖2 乳增寧膠囊樣品及其加標混合物的1H NMR譜圖Fig.2 NMR spectra of Ruzengning capsule sample and mixed chemical referencesA.sample；B.the enlarge part of Fig.A；C.mixture of sample and 2,3,5-triiodobenzoate；D.mixture of icariin and 2,3,5-triiodobenzoate

2.4.1NMR峰歸屬采用“1.2.3”方法分別測定淫羊藿苷標準品、內標2,3,5-三碘苯甲酸以及兩者混合物的NMR譜圖(見圖1)。對比圖1中的核磁圖，并參考文獻[34]，歸屬混合物(圖1C)中的各信號峰。

淫羊藿苷的峰：δ1.607(5”-H,s,3H)；δ1.691(4”-H,s,3H)；δ3.861(OCH3,s,3H)；δ5.013(Glc-1-H,d,1H)；δ5.165(2”-H,t,1H)；δ5.287(Rha-1-H,d,1H)；δ6.638(6-H,s,1H)；δ7.126～7.143(3’,5’-H,d,2H)；δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)；δ12.574(5-OH,s,1H)。

2,3,5-三碘苯甲酸峰：δ7.749～7.751(d,1H)；δ8.330～8.338(d,1H)。

2.4.2定量峰的確認采用“1.2”方法，測得樣品1的NMR圖譜見圖2A，樣品和內標物混合物的NMR譜圖見圖2D。

qNMR定量峰需滿足分離度較好，信噪比≥150等要求。圖2C中識別的兩個淫羊藿苷的特征峰1和2均能滿足要求，由于峰1處的基線較平，更適合做定量峰，因此選擇δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)(圖2C峰1)作為定量峰。同樣，根據條件選擇δ8.330～8.338(d,1H)作為內標的定量峰(圖2C峰IS)。

2.4.3核磁實驗參數的影響分別考察了脈沖寬度P1、延遲時間d1和掃描次數NS對積分面積的影響。當P1≥14.1 μs，d1=1 s，NS≥256時，淫羊藿苷定量峰和內標定量峰的信噪比可以達到定量要求(S/N≥150)，且測定的Ar與As值趨于穩定。故實驗選定核磁參數P1=14.1 μs，d1=1 s，NS=256。

2.4.4對2,3,5-三碘苯甲酸及淫羊藿苷純品的含量校正實驗使用的淫羊藿苷和內標采用qNMR法進行含量校正。在“1.2.3”實驗條件下，以DMSO為溶劑，基準物質鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰H-4,5(7.502～7.520,dd,2H)與三碘苯甲酸的NMR定量峰互不干擾。所以選擇鄰苯二甲酸氫鉀作為校準2,3,5-三碘苯甲酸(定量峰為H-4(δ7.695～7.699,d,1H ))和淫羊藿苷(定量峰δ7.126～7.143(3’,5’-H,d,2H))含量的內標物質。采用定量核磁共振技術的絕對定量模式對內標和淫羊藿苷純品進行含量校正。重復試驗6次，取平均值。實驗測得內標的含量為99.3%，RSD為0.59%；淫羊藿苷純品含量為96.4%，RSD為0.65%。以下實驗使用校正后的含量值進行。

2.5 方法驗證

2.5.1精密度取樣品1按照“1.2.1”方法制成待測樣品，分別在日內和日間各做6組測試，以淫羊藿苷定量峰δ7.890～7.909(2’,6’-H,d,2H)與內標峰δ8.330～8.338(d,1H)的積分面積(As/Ar)為指標，驗證qNMR方法的精密度。日內RSD為0.43%，日間RSD為0.75%。表明定量核磁共振技術的精密度好，樣品的穩定性好。

2.5.2線性與分析性能稱取6組淫羊藿苷(0.403 3～2.111 mg)和1.5 mg內標，溶解于0.5 mL氘代DMSO中，超聲溶解后，按“1.2”方法獲得核磁共振譜圖。選擇淫羊藿苷與2,3,5-三碘苯甲酸質量比(x)為橫坐標，核磁共振圖譜中淫羊藿苷與2,3,5-三碘苯甲酸峰面積比(y)為縱坐標，進行線性擬合。得到標準曲線為y=1.432 7x,相關系數r=0.999 9。

根據“1.2.3”公式(1)理論計算出淫羊藿苷線性曲線的斜率(Es/Er)為1.477 3,與實驗中測得淫羊藿苷標準曲線的斜率值接近，說明在實際樣品測定時，可以采用qNMR技術的絕對定量公式來直接計算淫羊藿苷的含量，而不必使用對照品。

2.5.3檢出限與定量下限根據2015版中國藥典四部通則[14]，qNMR的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)由基于響應值標準偏差和標準曲線斜率的公式LOD = 10δ/S，LOQ = 3.3δ/S得到，式中δ采用標準曲線的剩余標準偏差來計算。得淫羊藿苷的LOD=0.020 3 mg，LOQ=0.061 4 mg。本實驗中內標的用量約為1.5 mg，溶劑0.5 mL計算得淫羊藿苷的LOD=0.061 g/L，LOQ=0.184 g/L。英國藥典[35]對qNMR方法要求信噪比S/N≥150∶1，這也被認為是LOQ的指標，以樣品1的NMR測定譜峰信噪比，根據定量核磁共振技術的絕對定量公式[14-15]計算得淫羊藿苷的LOQ為0.173 g/L。綜上，可以認為本方法對淫羊藿苷的LOQ為0.184 g/L，LOD為0.061 g/L。按照本實驗中約0.5 mL溶劑的量和約0.25 g乳增寧的樣品量，可算出本法測定乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的LOD為0.122 mg/g；LOQ為0.368 mg/g，相當于0.036 8%(質量分數)。

表1 樣品提取后的qNMR方法回收率(n=3)Table 1 Recovery of icariin by qNMR after the sample extraction(n=3)

表2 包括樣品提取過程的SPE/qNMR方法回收率(n=3)Table 2 Recovery of icariin including the extraction process(n=3)

2.5.4樣品提取后qNMR方法的回收率取樣品用“1.2”方法測定其中淫羊藿苷的含量，然后將相同的樣品提取溶液再取3份，在每份溶液中加入淫羊藿苷標準品(淫羊藿苷對照品含量為96.4%)后再測定含量，計算除去樣品提取過程的qNMR方法的加標回收率，結果見表1。淫羊藿苷的回收率為98.1%～100.2%，RSD為1.1%。

2.5.5包括樣品提取過程的SPE/qNMR方法回收率分別準確稱取3份0.25 g樣品1，每份均加入一定量的淫羊藿苷標準品，用“1.2”提取分析方法對樣品進行定量。結果如表2，得到包括樣品SPE預處理過程的淫羊藿苷的回收率為99.8%～103.0%，RSD為1.6%。

2.6 樣品分析

按“1.2”方法，稱取不同廠家和批號不同的乳增寧膠囊內容物，重復測定3次樣品1、2、3的平均值分別為3.95、4.39、4.11 mg/g,RSD分別為1.9%、1.4%和0.75%。按照2015版中國藥典每粒乳增寧膠囊中的淫羊藿苷的測定不低于1.5 mg/g[16]的規定，3個樣品均符合要求。

3 結 論

建立了SPE/qNMR測定乳增寧膠囊中淫羊藿苷含量的方法，將樣品通過SPE進行富集純化，改善了qNMR的檢測靈敏度。方法精密度好，定量分析結果可靠，在實際樣品測定時，可以不用淫羊藿苷對照品，直接以qNMR絕對定量公式來計算淫羊藿苷的含量。

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