基于α-葡萄糖苷酶抑制率的樺褐孔菌多糖提取工藝優化

王昭潤,劉 萍,榮瑞芬,吳曉彤*

(1.內蒙古大學 生命科學學院,內蒙古 呼和浩特 010020；2.中國農業大學 食品科學與營養工程學院,北京 100083；3.北京聯合大學 生物化學工程學院,北京 100023)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又稱白樺茸,是生長在白樺樹上的真菌,主要分布在北緯45～50°的地區(如北美北部,芬蘭,俄羅斯,中國黑龍江、吉林省長白山地區等［1］)。其是一種食藥型真菌［2］,16世紀東歐一些國家的民間就用這種菌的菌核來防治癌癥［3］,俄羅斯Komsomlshi制藥公司發現樺褐孔菌精粉對糖尿病的治愈率為93%［4］。隨著對樺褐孔菌化學成分研究的不斷深入,發現樺褐孔菌含有多種具有生物活性的成分(如多糖、三萜類化合物、木脂素、樺褐孔菌醇、黑色素等［5-6］),其中樺褐孔菌多糖是中藥多糖的一種,幾乎無毒副作用［7］,因具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節［8-12］等多種生物活性而受到廣泛研究,但前人對樺褐孔菌多糖降血糖活性研究較少,本實驗室前期研究發現,樺褐孔菌多糖具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,α-葡萄糖苷酶抑制率可作為降血糖的活性考察指標。目前真菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、堿提法、酸提法、酶提法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等［15］。在樺褐孔菌多糖的提取中,通常以多糖提取率為考察指標［16-18］,而忽略了對多糖生物活性的評價,這可能會影響高活性多糖的提取。響應面優化法(response surface methodology,RSM)是通過合理的試驗設計擬合因素與響應值之間的函數關系,以尋求最優工藝參數［19］。目前該方法已被廣泛地應用于食品、化學、藥學等領域［20-22］。為了獲得具有高α-葡萄糖苷酶抑制率的樺褐孔菌多糖,本試驗以樺褐孔菌多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率及提取率為評價指標,在單因素試驗基礎上,采用響應面試驗法對樺褐孔菌多糖的提取條件進行優化。以期為樺褐孔菌多糖的進一步開發利用提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌：大興安嶺品味食品有限公司,粉碎后過40目篩,陰涼干燥處保存待用；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,pNPG)：美國Sigma公司；96孔酶標板：美國Corning公司；透析袋(截留分子質量3 500 Da,50 mm×5 m)：北京經科宏達生物技術有限公司；層析柱(2.6 cm×25 cm)：上海華美實驗儀器廠。

1.2 儀器與設備

TGL-16C離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1810紫外分光光度計：上海棱光科技有限公司；BT-200B真空泵：鄭州恒巖儀器有限公司；M200 pro多功能酶標儀：Tecan集團奧地利有限公司；N-1000-VN旋轉蒸發儀：鄭州恒巖儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

稱取5 g樺褐孔菌子實體粉末,按照一定的料液比加入去離子水,在一定的溫度條件下水提,提取完成后,取混合溶液離心(10 min、4 000 r/min),收集上清液,在60℃條件下,旋轉蒸發至適當體積,加入無水乙醇,4℃過夜醇沉后8 000 r/min離心10 min,收集沉淀,于烘箱中50℃干燥,至質量恒定即得水提多糖。

1.3.2 單因素試驗

在提取溫度90℃,提取時間為4h,料液比為1∶25(g∶mL),醇沉倍數為3倍的條件下,固定其他3因素,分別考察不同提取溫度(30℃、50℃、70℃、90℃、95℃),提取時間(2 h、3 h、4 h、5 h、6 h),料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g∶mL)),醇沉倍數(2、3、4、5)對高活性多糖提取工藝的影響。

1.3.3 響應面優化試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上,采用Design Expert 8.0.5中的Box-Benhnken中心組合設計法,選擇提取溫度(A)、提取時間(B)和提取料液比(C)3個因素,進行3因素3水平分析試驗。以多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)為響應值,每個試驗組合重復3次,優化多糖提取工藝,響應面試驗因素與水平如表1。

1.3.4 測定方法

總糖的測定：按照參考文獻［23］的方法測定樣品總糖含量。

粗多糖提取率的測定：紫外分光光度計測定波長485nm處的吸光度值,從標準曲線上查得相應含量,計算粗多糖含量。粗多糖提取率的計算公式如下：

式中：yt為粗多糖的提取率,%；w0為樺褐孔菌的質量,g；w1為測定多糖的質量,g。

α-葡萄糖苷酶抑制率的測定：參照參考文獻［24］的方法略加修改,計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取時間對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖1。由圖1可知,多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率均隨提取時間的延長而逐漸提高,提取3 h時,多糖提取率較高,為4.03%；3h后多糖提取率變化較小,保持在4.03%～4.09%；α-葡萄糖苷酶抑制率在提取3 h時迅速升高至85.73%,之后仍緩慢升高,提取5 h時達到最高為88.98%。當提取時間達到3 h以后,多糖提取率和粗多糖α-葡萄糖苷酶抑制率變化均較小,而隨著提取時間的延長,其他小分子活性物質的含量也會相應提高,會降低多糖在溶液中的比例,增加后期多糖分離純化的難度。因此選擇提取時間3 h最為適宜。

圖1 提取時間對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

2.1.2 提取溫度對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取溫度對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

由圖2可知,提取溫度為30～90℃時,多糖提取率及α-葡萄糖苷酶抑制率均隨溫度的升高呈現快速升高趨勢。提取溫度為90℃時多糖提取率及α-葡萄糖苷酶抑制率分別為4.41%和86.73%；提取溫度高于90℃之后,多糖提取率略微下降,α-葡萄糖苷酶抑制率變化不大。因此選擇提取溫度90℃最為適宜。

2.1.3 料液比對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

提取過程中料液比對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖3。由圖3可知,料液比為1∶15～1∶40(g∶mL)時,隨著提取溶劑量增加,多糖提取率逐漸增加,料液比為1∶30(g∶mL)時,多糖提取率最高,為4.02%；料液比＞1∶30(g∶mL)后提取率不再增加,表明多糖提取完全。提取料液比對α-葡萄糖苷酶抑制率影響作用并不明顯,基本保持在80%左右。由此判斷,多糖提取率與多糖活性之間并非存在正比關系,單一以多糖提取率為指標研究提取工藝存在一定的局限性,同時以多糖活性為多糖提取工藝考察指標,更具有全面性和有效性。因此選擇提取料液比為1∶30(g∶mL)最為適宜。

圖3 料液比對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

2.1.4 醇沉倍數對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖4 醇沉倍數對多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of alcohol precipitation multiple on the polysaccharide extraction rate andα-glucosidase inhibition rate

提取過程中醇沉倍數對多糖提取率和粗多糖α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖4。由圖4可知,隨著醇沉倍數增加,多糖提取率有所增加,而α-葡萄糖苷酶抑制率略有下降趨勢,但變化幅度都不大,多糖提取率在3.5%～4.0%,α-葡萄糖苷酶抑制率在80%～85%。醇沉倍數為3倍時,多糖提取率最高,但此時α-葡萄糖苷酶抑制率較醇沉倍數為2倍時低,醇沉倍數增加,能獲得更多的多糖,但不一定是具備α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖,同時推測具備α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖對醇溶液濃度有選擇性。因此選定醇沉倍數為2倍最為適宜。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面優化提取樺褐孔菌多糖工藝

在單因素試驗結果的基礎上,以提取溫度(A)、提取時間(B)和提取料液比(C)為自變量,固定醇沉倍數為2倍,以多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)為響應值進行3因素3水平分析試驗。試驗共有17組,試驗設計及結果如表3所示。

表3 多糖提取工藝優化響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface experiments for polysaccharide extraction process optimization

2.2.2 多糖提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型的建立及顯著性檢驗

對表3的數據進行回歸分析,得到多糖提取率(Y1)和α-葡萄糖苷酶抑制率(Y2)的回歸模型：

Y1=4.31+0.32A+0.005 25B+0.087C+0.083AB-0.048AC+0.083BC-0.11A2-0.2B2-0.017C2

Y2=90.34+7.67A+0.66B+0.59C+0.26AB+0.055AC+1.27BC-5.65A2-2.08B2-1.81C2

回歸方程的方差分析見表4、表5。從表4可以看出,多糖提取率Y1回歸模型極顯著(P＜0.01),失擬項不顯著(P＞0.05),說明該模型可以擬合試驗結果。決定系數R2=0.9041,說明模型響應值的變化有90.41%來自所選因變量,因此,該回歸方程可以描述各因素對多糖提取率的影響。該模型一次項A影響極顯著(P＜0.01)。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

從表5可以看出,α-葡萄糖苷酶抑制率Y2模型極顯著(P＜0.01)。Y2模型失擬項不顯著(P＞0.05),該模型選擇合適。Y2模型的校正決定系數R2為0.990 1,說明模型響應值的變化有99.01%來自所選因變量,進一步說明模型擬合優度較好。因此該回歸方程可以描述各因素對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。該模型一次項A,二次項A2、B2、C2影響極顯著(P＜0.01),交互項BC影響顯著(P＜0.05)。

表5 α-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model forα-glucosidase inhibition rate

2.2.3 響應曲面圖分析

響應值Y1和Y2與3個因素A、B、C構成的三維空間響應面圖見圖5～圖6。

圖5 提取溫度、提取時間和料液比交互作用對多糖提取率影響的響應曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between extraction temperature,time and solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

圖6 提取溫度、提取時間和料液比交互作用對α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between extraction temperature,time and solid-liquid ratio on α-glucosidase inhibition rate

由圖5可知,提取溫度對多糖提取率影響顯著,隨著提取溫度的升高,多糖提取率上升趨勢逐漸變緩,而隨著提取時間的延長,多糖提取率先上升后保持穩定；多糖提取率隨著提取料液比和提取溫度的增加(升高)而不斷增加,其中提取溫度的影響更為顯著；提取時間對多糖提取率的影響比提取料液比顯著,因為前者的變化趨勢更為明顯。多糖提取率隨提取時間的增加先上升后下降,并且當提取料液比越大時,這種趨勢越明顯。

由圖6可知,α-葡萄糖苷酶抑制率隨提取溫度的升高而不斷增加,隨提取料液比的變化α-葡萄糖苷酶抑制率變化不明顯。這與單因素試驗結果一致；提取溫度對α-葡萄糖苷酶抑制率影響顯著,隨著提取溫度的升高,α-葡萄糖苷酶抑制率先上升后保持穩定,而提取時間對α-葡萄糖苷酶抑制率影響較低；α-葡萄糖苷酶抑制率隨著提取時間和提取料液比的增加呈現先上升后下降的變化趨勢,當提取時間為3 h,提取料液比為1∶30(g∶mL)時,有最大的α-葡萄糖苷酶抑制率。

2.2.4 響應面優化結果驗證

結合實際情況與響應面優化所得最佳條件,確定提取時間為3.5 h,提取溫度為95℃,提取料液比為1∶30(g∶mL),在此條件下進行多糖提取,并對多糖提取率和單位濃度多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率進行測定,在此條件下,3次多糖提取率平均值為4.61%,α-葡萄糖苷酶抑制率平均值為92.34%,與理論值相差1.5%和0.47%,因此,響應面法所得樺褐孔菌多糖提取條件的回歸方程模型是可行的,具有實際應用價值。

3 結論

本研究以α-葡萄糖苷酶抑制率和多糖提取率為考察指標,在單因素試驗的基礎上,通過響應面分析法優化多糖提取工藝,得出高活性樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝為提取溫度95 ℃,提取時間3.5 h、提取料液比1∶30(g∶mL),醇沉倍數2倍,在此條件下,多糖提取率為4.61%,α-葡萄糖苷酶抑制率為92.34%,

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