糠醛渣的預處理、酶解優化及同步糖化發酵

李喬丹,劉 彬,莊倩倩,劉同軍*

(齊魯工業大學(山東省科學院)生物工程學院,山東 濟南 250353)

糠醛是一種重要的化工原料,其衍生的化工產品高達上千種,廣泛應用于醫藥、農藥、紡織和石油等行業［1］。近年來,我國的糠醛生產工藝發展迅速,已然成為糠醛的生產和出口大國。工業上一般用玉米秸稈,玉米芯等原料生產糠醛［2-3］。每年在我國能產生幾千萬噸的糠醛渣廢料,怎樣合理利用糠醛渣是現如今所需要面臨的難題,這對于環境保護,開發新能源上有重大意義［4-5］。近些年來,人們對糠醛渣也做了大量的研究。在20世紀90年代,楊柳青等［6］將糠醛渣作為土壤改良劑,將一些鹽堿地成功改良,結果顯示糠醛渣有明顯的改土增產,增肥地力的作用。岳中輝等［7-8］對糠醛渣的研究發現,將糠醛渣作為棉籽殼、稻殼的替代產品應用于作物培育,在解決污染問題的同時緩解了供需矛盾,降低生產成本,實現雙贏。汪南方等［9］報道,可以利用糠醛渣進行微波輻照來制備活性炭,這樣降低了活性炭的生產成本,具有一定的經濟效益和社會效益。孫冉等［10］研究了糠醛渣在發酵罐中同步糖化發酵生產纖維乙醇的過程,為糠醛渣轉化纖維乙醇實現工業化提供了一些理論依據。

隨著化石燃料的不斷開采,石油在國際上已經供不應求,價格也越來越高,并且伴隨著化石燃料的過度使用,出現越來越嚴重的環境問題,如溫室效應、酸雨等。為了解決化石燃料的過度使用所帶來的環境和能源危機等問題,人們一直在尋求一種可持續的清潔能源,那就是生物質能源,包括生物乙醇和生物柴油。其中生物乙醇是目前最重要的一種生物燃料,它已經占了生物燃料的使用量90%以上,近年來掀起了一股怎樣實現規模化生產纖維素乙醇的浪潮［11-13］。由于糠醛渣含有豐富的纖維素,它是工業上生產纖維乙醇的潛在原料［14-15］。但大部分企業受技術條件的限制,無法解決生產成本的問題,所以都沒有實現糠醛渣的規模工業化再利用。

目前,這一研究也受到了廣泛的重視,糠醛渣含有較高的木質素,通過堿性過氧化氫(alkalinehydrogen peroxide,AHP)預處理后能有效地脫除木質素,能有效的提高糠醛渣的酶解轉化率。本研究的目的就是通過AHP預處理糠醛渣來提高它酶解的轉化率,從而提高糠醛渣的糖收益。同時,還研究了水洗過程對糠醛渣酶解的影響。通過正交試驗對糠醛渣同步糖化發酵(simultaneous saccharification fermentation,SSF)進行優化,以期為糠醛渣生物乙醇工業化生產探索出合理有效的途徑。

1 材料與試劑

1.1 材料與方法

1.1.1 原料

糠醛渣由山東省德州市寧津開源化工有限公司提供,自然風干后,水分含量為7.12%,經粉碎機粉碎后過40目篩,密封保存。

1.1.2 試劑

纖維素酶(310 FPU/mL)、半纖維素酶(600 FPU/mL)、果膠酶(500 U/g)：丹麥諾維信(中國)有限公司；釀酒活性干酵母(耐高糖型)：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；葡萄糖：天津市科密歐化學試劑有限公司、硫酸溶液：萊陽經濟技術開發區精細化工廠；NaOH溶液：天津博迪化工股份有限公司；H2O2：萊陽經濟技術開發區精細化工廠。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PB-10型pH計：德國賽多利斯公司；MQD-B3NR型恒溫振蕩培養箱：上海旻泉儀器公司；LC-20A型高效液相色譜儀：日本島津公司；iCen24型高速離心機：杭州奧盛儀器有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；CR-MJ-12型馬弗爐：洛陽昌瑞爐業有限責任公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；9FZ～23型齒爪式粉碎機：四川漸飛機械制造有限公司；UV-5500PC紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 AHP預處理

按照NaOH 0.1 g/g糠醛渣,H2O20.025 g/g糠醛渣加量,稱取10 g糠醛渣于250 mL錐形瓶中,稱取1 g NaOH溶于99.24 mL水中,攪拌均勻,倒入錐形瓶中,與底物充分攪拌,然后用移液器吸取758μL H2O2加入到錐形瓶中,用5 mol/L NaOH調節pH至11.7,將錐形瓶放置在恒溫振蕩器中振搖,轉速為160 r/min,振搖24 h,即可得到糠醛渣的預處理液。

1.3.2 糠醛渣的水洗

將AHP預處理過后的糠醛渣用16層紗布進行過濾,用自來水緩慢沖洗,每次100 mL,并用玻璃棒不斷攪拌,重復3～5次,直至過濾出的水呈中性即可完畢。

1.3.3 糠醛渣同步糖化發酵

通過單因素試驗,確定了反應的最適溫度為30℃,最適pH為4.9,最適酶用量為20 mg酶蛋白/g葡聚糖,最適發酵時間為72 h。在單因素試驗基礎上,采用正交試驗對SSF乙醇工藝進行優化,通過考察反應溫度、pH、酶用量、發酵時間等4個因素,選用L9(34)正交表進行優化設計。用體積分數為72%的H2SO4將AHP預處理24 h的糠醛渣調節pH,高溫蒸汽滅菌(121℃、20 min)；冷卻后加入規定量的纖維素酶,酵母活化后按發酵體積的10%接種,用保鮮膜封口,并且在橡皮塞上插上一枚注射用鋼針以釋放發酵過程中產生的二氧化碳,放置在搖床上,按照規定的反應溫度進行搖瓶厭氧發酵,轉速為160r/min。定時取樣,每24h取1次,每次400μL發酵液,離心分離,取100μL上清液,稀釋10倍,用于檢測葡萄糖和乙醇濃度。

酵母的活化：稱取0.64g干酵母加入到200mL 2%的葡萄糖水溶液中,放置在30℃搖床中振搖2 h,轉速為160 r/min,得到酵母活化液。

SSF培養基配料比：蛋白胨0.5 g,100 mL糠醛渣預處理液(含糠醛渣原料20 g)。

1.3.4 分析方法

糠醛渣主要成分分析：纖維素,木質素及其他主要成分測定參照美國國家可再生能源實驗室(national renewable energy laboratory,NREL)標準方法進行測定［16］。

葡萄糖及酒精濃度使用高效液相色譜法進行測定,其色譜條件為：Aminex-HPX87H色譜柱(100 mm×7.8 mm),示差-折光檢測器,流動相0.005 mol/L H2SO4,柱溫65℃,流速0.6 mL/min,示差檢測器溫度為30℃,進樣量20μL,通過建立標準曲線對葡萄糖和乙醇濃度進行計算。葡萄糖轉化率和乙醇理論轉化率的計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 糠醛渣成分分析

采用NREL法進行成分分析的結果如圖1所示。由圖1可知,糠醛渣的纖維素含量為47.35%,木質素含量為39.81%,與未處理的生物質原料如玉米秸稈、玉米芯、小麥秸稈等作物秸稈相比,糠醛渣纖維素含量相對較高,半纖維素含量非常低,理論上來講,如果能轉化成葡萄糖就可以轉化成液體燃料或其他高附加值化學品［17-18］。

圖1 糠醛渣成分分析Fig.1 Components analysis of furfural residue

2.2 預處理對酶解的影響

按照1.3.1的實驗方法,分別對5%、10%、15%、20%、25%這5種底物濃度的糠醛渣進行AHP預處理。預處理過后,向每一種底物的糠醛渣中加入纖維素酶,加酶量為30 mg酶蛋白/g葡聚糖,加完酶后將每種底物濃度的糠醛渣放置在50℃的搖床中,振搖24 h后,酶解過程結束,酶解結果如圖2所示。由圖2可知,通過AHP預處理過的糠醛渣酶解轉化率明顯高于未預處理的糠醛渣,其中10%底物濃度24 h酶解轉化率最高,為96.46%,未預處理的糠醛渣的酶解率為70.19%,相比于未預處理的酶解轉化率提高了37.44%。15%底物濃度的預處理的糠醛渣酶解轉化率為89%,而未預處理的只有76.91%。20%底物濃度的糠醛渣中,預處理的酶解率為88.91%高于未預處理的81.63%。玉米芯、玉米秸稈等農作物秸稈的木質素含量大約在30%～35%,而本研究的糠醛渣木質素含量為39.58%,所以糠醛渣的木質素含量相對于其他的農作物秸稈來說較高。木質素是纖維素和半纖維素轉化成單糖的主要障礙,據文獻［19-20］報道,H2O2能夠脫除木質素,并且保留了絕大部分的纖維素。因為在堿性條件下,H2O2會分解生成HOO-,使木質素側鏈的雙鍵結構斷裂,從而降低木質素的分子質量,使之溶出。同時,木質素是堿溶性的,通過這雙重作用能夠明顯提高糠醛渣的酶解轉化率。

圖2 不同底物濃度對糠醛渣葡萄糖轉化率的影響Fig.2 Effect of different furfural residue substrate concentration on transformation rate of glucose

通過比較5%,10%,15%三種底物濃度的酶解轉化率隨時間的變化趨勢可知(見圖3),糠醛渣在0～24 h的酶解轉化率迅速升高,在24 h后,酶解轉化率升高非常緩慢,最后逐漸趨于平衡。在24 h時3種底物濃度的糠醛渣的酶解轉化率就分別達到了97.86%、96.46%、94.29%。王東等［21］利用堿預處理過的稻草秸稈酶解轉化成葡萄糖研究認為酶解24 h后轉化率的提高不大,主要是因為隨著酶解時間的增加,酶活力下降,降解纖維素的能力下降,從而導致24h后纖維素轉化率提高不大。而本研究認為5%,10%底物濃度的酶活下降可能是由于酶活力下降導致的,而在15%濃度時,水解效率降低的原因是多方面的,主要因素可能是底物濃度較高,體系里的水比較少,隨著反應的進行,體系的傳質問題會逐漸影響葡萄糖的水解。而且降解出來的纖維素類基質會釋放拮抗因子、降解產物葡萄糖的積累也會產生阻遏效應,這些都能夠影響酶解的轉化率。由于24 h之后酶解轉化率提升較低,所以確定糠醛渣酶解的最優時間為24 h。

圖3 不同底物濃度對AHP預處理的糠醛渣葡萄糖轉化率的影響Fig.3 Effect of different substrate concentration on transformation rate of glucose of AHP pretreated furfural residue

2.3 加酶量的優化

以酶解轉化率為考察指標,利用Design-Expert8.0軟件進行Mixture設計,其試驗方案與結果如表1所示。

表1 Mixture設計試驗結果Table 1 Results of Mixture experiments design

2.3.1 回歸模型的建立

通過Mixture設計與分析,以酶解轉化率為考察指標,使用Design-Expert8.0軟件對表1中數據進行二次回歸擬合后,得到酶解最優加酶組合的回歸模型為：

Y=78.01A+45.36B+8.05C+10.75AB+71.95AC+26.62BC

2.3.2 回歸方程的顯著性檢驗與方差分析

Mixture設計分析對試驗結果進行擬合的二次模型方差分析見表2。由表2可知,總回歸方程F檢驗P＜0.000 1,達到極顯著水平,說明該模型與實際結果擬合非常好,該回歸模型的決定系數R2為0.964 1,即該模型可以解釋酶解轉化率96.41%的變化。

表2 回歸模型顯著性檢驗Table 2 Significance test of regression model

回歸方程各項的方差分析結果還表明,AB、AC及BC的交互作用對酶解轉化率的影響均達到極顯著水平(P＜0.01)。其中,各因素交互作用對酶解轉化率的影響順序分別為：AC＞BC＞AB。

2.3.3 影響酶解轉化率的響應面分析

以酶解轉化率為響應指標值,對纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等3個因素進行響應面分析,其相應的響應面和等高線圖如圖4所示。從圖4可直觀地看出,3個因素之間的交互作用對酶解轉化率的影響。圓形表示兩者之間的交互作用不顯著,而橢圓表示兩者之間的交互作用顯著。由圖4可知,半纖維素酶和果膠酶之間的交互作用顯著(P＜0.05),而纖維素酶和果膠酶之間的交互作用較顯著(P＜0.01),纖維素酶和半纖維素酶之間的交互作用不顯著(P＞0.05)［22-25］。

通過對酶解轉化率的回歸模型進行多項數學解逆矩陣以及相關的數學分析,得到在糠醛渣在酶解時的最優加酶組合為96%纖維素酶、2%半纖維素酶、2%果膠酶(添加量為30 mg酶蛋白/g葡聚糖),在此酶解條件下,酶解轉化率的理論預測值為78.01%,平行3次試驗,測定的酶解轉化率的平均值為78.81%,與預測值相差僅為0.60%。所以,采用Mixture設計法優化得到的酶解加酶量的參數準確可靠。

圖4 纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的交互作用對酶解轉化率影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase,hemicellulase and pectinase addition on enzymatic conversion rate

2.4 水洗對糠醛渣酶解的影響

糠醛渣在預處理過程中會產生一些由木質素衍生而來的酶解抑制物,而水洗過程可以去除一部分抑制物,這樣水洗過程會對酶解的效果產生一定的影響。按照1.3.2的實驗方法,通過單因子實驗,研究了水洗過程對10%、15%這兩種底物濃度的糠醛渣酶解的影響,結果見圖5。

圖5 水洗對糠醛渣酶解的影響Fig.5 Effect of water washing on enzymatic hydrolysis of furfural residue

由圖5可知,10%、15%的糠醛渣水洗之后,酶解轉化率有明顯的提高,其中15%的糠醛渣通過水洗后酶解轉化率達到了90.21%,相比于未水洗的糠醛渣酶解轉化率提高了18.23%。因為在酶解過程中,木質素會對纖維素酶有很大程度上的無效吸附,從而會影響糠醛渣的酶解過程,使得葡萄糖的轉化率不太高。通過水洗過程,可以大大降低木質素對纖維素酶的無效吸附。同時,木質素來源的纖維素酶抑制物也可大部分被去除。糠醛渣本身呈酸性,含有酶解抑制物,水洗過程也能去除一部分酶解抑制物,這使得葡萄糖的酶解轉化率明顯提高,所以水洗過程對糠醛渣的酶解轉化率提高有一定的幫助［26］。

2.5 SSF條件優化正交試驗結果

正交試驗結果見表3。由表3可知,其中各因素的影響順序為：酶用量＞發酵時間＞反應溫度＞pH。糠醛渣SSF最佳工藝條件為發酵時間96 h,反應溫度34℃,pH 4.6,酶用量30 mg酶蛋白/g葡聚糖,在此最佳條件下,乙醇的理論轉化率高達88.64%。

表3 同步糖化發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of simultaneous saccharification fermentation

孫亞東等［27］利用過堿化處理糠醛渣進行同步糖化發酵研究認為發酵罐中發酵時間在27 h時,乙醇的轉化率達到最大值,為72.33%,此時的乙醇濃度為7 g/L左右。雖然本研究的搖瓶同步糖化發酵中,發酵時間在72～96 h之間,乙醇轉化率才達到了最大值,但是本研究的最大乙醇濃度和轉化率要遠遠高于前者,可能是預處理的方式導致的。

3 結論

原料的成分分析表明,糠醛渣含纖維素47.35%,含木質素39.81%,含半纖維素1.57%,糠醛渣纖維素含量非常高,并且糠醛渣自身纖維素與半纖維素的結構已經被破壞,更容易進行酶解和發酵,是作為生物質能源的理想原料。

糠醛渣經過AHP預處理后,酶解的轉化率升高明顯,10%底物濃度的糠醛渣24 h的酶解轉化率為96.46%,比未預處理的糠醛渣轉化率提高了37.44%。而水洗過程也能在一定程度上提升糠醛渣的酶解轉化率,水洗之后,15%底物濃度的糠醛渣24 h的酶解轉化率為90.21%,比未水洗的糠醛渣轉化率提高了18.23%,說明在水洗過程中,能夠去除部分酶解抑制物,而且能夠降低木質素對纖維素酶的無效吸附作用。

通過Mixture設計并優化酶解的最優加酶量,建立回歸模型,通過響應面數據分析,確定了酶解的最優加酶量,即96%纖維素酶、2%半纖維素酶、2%果膠酶。

糠醛渣搖瓶同步糖化發酵的優化工藝為：反應溫度38℃,pH 4.6,酶用量30 mg酶蛋白/g葡聚糖。在此優化條件下,96 h乙醇的理論轉化率高達88.64%,為糠醛渣發酵罐試驗提供了一定的理論基礎。

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