不同有機氮源對發酵法生產肌苷影響的研究

何 峰,李 科,張曉紅,陳亭亭,楊 薇,項 俊*

(1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心,湖北 黃岡 438000)

肌苷又名次黃嘌呤核苷(inosine,IR),學名9-β-D-吠喃核糖次黃嘌呤核苷,是一類由次黃嘌呤與核糖形成的核苷類化合物。其分子式為C10H12NO5,分子質量為268.23［1］。在食品工業中,肌苷是合成5′-肌苷酸二鈉(disodiumeinosine-5′-monophosphate,IMP)最重要的前體物質,而5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉(I+G)是新一代安全的增鮮劑與營養劑——雞精的主要成分,廣泛應用于食品工業中［2-4］。肌苷是在人體中發現的化合物,在遺傳密碼正確翻譯時必不可少［5-7］。在醫藥工業中,肌苷參與人體的能量代謝和物質代謝,是僅有的可以代替人類自身三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的藥物。肌苷也是多種抗病毒核苷類藥物的前體物質。在醫療方面主要用于醫治白細胞和血小板的減少、活化肝功能、提高細胞內ATP水平等［8］,可以治療肝臟、心臟、血細胞以及視網膜等方面的疾病［9］。

肌苷的生產方法有菌體自溶法、發酵法和酶水解核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)法,由于菌體自溶法和酶水解RNA法產量低,提取困難,而發酵法具有周期短、易控制、易提取和成本低的優點。因此,廠家大多采用發酵法生產肌苷［10-12］。

目前,發酵法生產肌苷采用的菌種多為經過基因工程改造的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［13］,其對營養物質的要求非常高,稍有變化,就會大大影響肌苷的發酵水平和發酵產量的穩定性。絕大多數生產企業采用淀粉水解后的葡萄糖作為碳源,無機鹽是市售工業級產品,這些發酵培養基的組分參數比較容易控制。相對而言,不同生產企業采用的有機氮源各不相同,即使是同一氮源不同廠家的產品技術參數也有差異,而生產企業在采購有機氮源時往往容易忽視其差異性,從而導致肌苷發酵過程及肌苷產量的不穩定［14］。

本試驗以枯草芽孢桿菌(B.subtilis)HX1026為研究對象,選擇大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液為有機氮源,考察不同有機氮源對菌株HX1026發酵過程中生物量、殘糖含量和肌苷產量的影響,確定最適合菌株HX1026發酵生產肌苷的有機氮源；通過20 L發酵罐進行驗證實驗,并監測菌株HX1026發酵過程中肌苷晶體的形成過程,以期為大規模發酵生產肌苷過程中制定有機氮源的選擇標準奠定基礎,確保發酵過程中肌苷產量的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)HX1026：由菌株ATCC13952經過基因工程改造并多次誘變選育得到,現保藏于黃岡師范學院生命科學學院。

葡萄糖：市售淀粉在實驗室中自行水解制備,水解后葡萄糖含量為32.5%；KH2PO4、FeSO4、MgSO4(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；大豆蛋白胨(soybean peptone,SP)：山東青州市啟迪生物科技有限公司；豆粕水解液(soybean meal hydrolyzate,SMH)：購買市售飼料級豆粕在實驗室中自行水解制備；工業豆粕水解液：分別購于山東、河南、湖北,編號為山東1號、山東2號、河南1號、湖北1號；酵母粉(yeast powder,YP)、酵母抽提物：安琪酵母股份有限公司；玉米漿干粉(corn steep liquor powder,CP)：上海西王淀粉糖有限公司。

種子培養基：淀粉水解葡萄糖2%,酵母抽提物1%,硫酸銨0.5%,氯化鈉0.5%,磷酸二氫鉀0.3%,0.1MPa滅菌20min,滅菌后pH值6.8～7.0。

發酵基本培養基：葡萄糖20%,硫酸銨1%,磷酸二氫鉀0.3%,硫酸鎂0.5%,腺苷0.025%。在搖瓶培養過程中采用0.1 MPa滅菌20 min,滅菌后pH值6.8～7.0。在發酵罐培養過程中采用原位滅菌,滅菌后pH值6.8～7.0。

有機氮源采用不同濃度梯度的大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液。

1.2 儀器與設備

20 L自動控制發酵罐：德國B.Braun公司；Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)：美國安捷倫科技有限公司；B5100紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；5B-6D型智能型氨基酸態氮測定儀(V8版)：北京連華環保科技；Basler Power Pack顯微鏡相機：德國Basler公司；SKD-1000凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；SGD-Ⅳ型全自動還原糖測定儀：山東省科學院生物技術研究中心；ZWYR-2102C立式雙層恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵法制備肌苷工藝流程

將斜面B.subtilis HX1026種子活化后接種至搖瓶中,200 r/min、30℃恒溫培養36 h,培養過程中在波長600 nm處檢測培養液的光密度(optical density,OD),當OD600nm達到0.5～0.6時,以5%的接種量接種至發酵培養基中,200r/min、30℃恒溫培養60 h。

1.3.2 檢測方法

采用凱氏定氮法測定氮源的總氮［15］；高效液相色譜法測定肌苷含量［16-18］；采用分光光度法測定菌體生物量,以OD600nm值表示［19］。發酵液中糖含量用殘糖(residual sugar,RS)表示,并采用SGD-Ⅳ型全自動還原糖測定儀測定其含量［20］；采用甲醛滴定法檢測氨基酸態氮［21］。

1.3.3 有機氮源對菌株HX1026肌苷產量的影響

選取4種氮源：大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和自制豆粕水解液,總氮含量分別為8.0%、7.2%、4.5%和3.0%。每種氮源分別設置3種不同的濃度梯度,每種濃度梯度的不同氮源的總氮是相同的。分別添加到發酵培養基中進行搖瓶發酵,通過比較在總氮相同的情況下,檢測不同種類、不同濃度的氮源對應的肌苷產量,以確定最適有機氮源及其添加濃度。實驗方案見表1。

表1 不同種類、濃度的氮源Table 1 Different types and concentrations of nitrogen sources

1.3.4 有機氮源對菌株HX1026生物量和殘糖含量的影響

分別選取1.3.3節中肌苷產量最高的氮源濃度添加到發酵培養基中,在其他培養基組分、培養條件不變的情況下,在發酵過程中,每4 h測定菌體生物量、發酵液中殘糖含量,考察不同種類的氮源對菌株HX1026生長的影響以及菌株HX1026發酵過程中利用糖的情況。

1.3.5 不同廠家豆粕水解液對肌苷產量的影響

選擇山東1號、山東2號、河南1號、湖北1號4個編號的工業豆粕水解液,測定其總氮、氨基酸態氮、氨基酸態氮/總氮,并以1.3.3節中確定的肌苷產量最高濃度的豆粕水解液作為氮源,其他條件都不變,考察4個不同廠家的豆粕水解液對肌苷產量的影響。

1.3.6 20 L發酵罐驗證實驗

將培養好的菌株HX1026種子按照10%的接種量接種到20 L發酵罐中進行發酵,發酵罐裝液量為15 L。發酵條件為：攪拌轉速800 r/min,通氣量為22.5 dm3/min,培養溫度30℃、發酵過程中pH 7.0,培養時間60 h。以1.3.5中選擇的最佳濃度的豆粕水解液作為發酵培養的有機氮源,每4 h取樣,分別檢測菌體生物量、殘糖含量和肌苷產量。

1.3.7 發酵過程中肌苷晶體形成過程

每4 h從發酵罐中取樣,將樣品涂布在載玻片上,自然風干,利用顯微鏡觀察不同時間肌苷晶體的形成過程,進一步確認山東1號豆粕水解液是否適合于肌苷晶體形成。

2 結果與分析

2.1 有機氮源對肌苷產量的影響

考察不同有機氮源對肌苷產量的影響,結果如表2所示。由表2可知,以不同濃度的大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉及豆粕水解液作為氮源時,肌苷的產量相差較大。當總氮相同時,豆粕水解液作為氮源,肌苷產量最高。當豆粕水解液含量為3.6%時,肌苷產量達到29.6 g/L。因此,可以選擇豆粕水解液作為菌株HX1026發酵生產肌苷的最佳有機氮源。

表2 不同濃度的4種有機氮源對肌苷產量的影響Table 2 Effects of four nitrogen sources with different concentrations on the yield of inosine

2.2 有機氮源對發酵過程中HX1026生物量影響

在接種量、其他培養基組分、培養條件相同的情況下,不同濃度的4種有機氮源在發酵過程中對菌體HX1026生物量的影響如圖1所示。

圖1 不同氮源對菌株HX102生物量的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on biomass of strain HX102

由圖1可知,隨著發酵時間的延長,各有機氮源的菌株生物量均呈先增加后逐漸趨于平穩的趨勢,在0～24 h,當有機氮源為豆粕水解液時,菌體生長極為迅速,生物量(OD600nm值)快速增至0.806；而當有機氮源為大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉時,生長相對緩慢,在24 h時對應的OD600nm值分別是0.610、0.660、0.651。且整個發酵過程中,豆粕水解液對應的OD600nm值均高于同期的其他3種氮源,說明豆粕水解液作為有機氮源更有利于菌株HX1026菌體的生長。

2.3 有機氮源對發酵過程中殘糖含量的影響

不同有機氮源對發酵過程中殘糖含量的影響如圖2所示。

圖2 不同氮源對發酵過程中殘糖含量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the residual sugar content in the fermentation process

由圖2可知,除玉米漿干粉外,其他有機氮源發酵液中殘糖含量隨著發酵時間的延長先緩慢下降,說明菌株利用糖的速度較緩慢,當發酵至16 h后,殘糖含量迅速下降,在相同發酵時間點,以豆粕水解液為氮源時,糖利用速度略快,到發酵結束時(60 h)殘糖含量為0.32%,而以大豆蛋白胨和酵母粉為氮源時,殘糖含量分別為3.10%和1.50%；當以玉米漿干粉作為氮源時,發酵前期(0～24 h),菌株對糖的利用速度非常快,但從32 h后糖利用速度變慢,直到發酵結束還有2.90%的殘糖。因此,當以豆粕水解液作為氮源時,菌體HX1026利用糖的速度適中,糖利用充分,有利于菌株HX1026發酵生產肌苷。

2.4 4種有機氮源技術參數測定

檢測4種有機氮源的總氮和氨基酸態氮含量,并計算氨基酸態氮/總氮比值,結果如表3所示。

表3 4種有機氮源的氨基酸態氮和總氮含量比較Table 3 Comparison of amino acid nitrogen and total nitrogen contents of four nitrogen sources

由表3可知,盡管豆粕水解液中的總氮和氨基氮含量均低于大豆蛋白胨、酵母粉和玉米漿干粉,但豆粕水解液的氨基酸態氮/總氮比值最高,達到0.623。當培養基中總氮含量相同時,豆粕水解液作為氮源的培養基中氨基酸態氮含量最高,微生物在生長時優先利用氨基酸態氮,這可能是菌株HX1026在豆粕水解液中生長速度最快的原因。當發酵液中氨基酸態氮消耗完后,菌株HX1026需要產生蛋白酶水解總氮中的非氨基酸態氮滿足菌株生長和代謝。大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉總氮含量高,但氨基酸態氮/總氮比值較低,說明這三種氮源中非氨基酸態氮含量高。因此,在利用這3種氮源進行肌苷發酵的中后期(40～60 h),菌株HX1026生長速度變慢,殘糖較多,肌苷產量較低。結果說明豆粕水解液是菌株HX1026最適合的有機氮源,同時也說明在選擇有機氮源時要兼顧總氮、氨基酸態氮以及氨基酸態氮/總氮的比值,確保菌株HX1026發酵過程中肌苷產量始終處于較高水平。

2.5 不同廠家豆粕水解液對肌苷產量的影響

表4 不同廠家豆粕水解液的技術參數及對肌苷產量的影響Table 4 Technical parameters of soybean meal hydrolysate from different factories and the effects on the yield of inosine

由表4可知,不同廠家豆粕水解液的總氮、氨基酸態氮、氨基酸態氮/總氮等技術參數各不相同,而且對肌苷產量的影響也存在較大差異。其中,山東1號的總氮、氨基酸態氮均高于其他三個廠家的水解液,其對應的肌苷產量也明顯高,達到31.2 g/L。山東2號的氨基酸態氮/總氮值稍高于山東1號,但豆粕水解液的濃度相同時,其總氮和氨基氮均低于山東1號,其對應的肌苷產量低于山東1號。因此,在選擇氮源時,不僅氮源種類很重要,即使同一種氮源,不同廠家生產的產品技術參數如總氮、氨基酸態氮、氨基酸態氮/總氮等也存在較大差異,從而導致肌苷產量出現差異。這意味著在選擇豆粕水解液作為肌苷發酵氮源時,需要建立嚴格的質量標準,以后在采購豆粕水解液時,應參照山東1號的質量標準,否則有可能因為氮源的差異影響肌苷的產量,從而影響肌苷發酵的穩定性。

2.6 20 L發酵罐驗證實驗

以山東1號為有機氮源,利用20L發酵罐對菌株HX1026發酵過程進行驗證,考察發酵過程中生物量、殘糖含量及肌苷產量變化,結果如圖3所示。由圖3可知,菌株HX1026生物量和肌苷產量的變化趨勢基本一致,從第12小時開始,菌體OD600nm值快速增加,肌苷產量也快速增加,與之相對應的發酵液中殘糖含量從第12小時快速減少,發酵至60 h時殘糖含量幾乎為零。在發酵結束時,肌苷產量達到51.2g/L,遠高于山東1號在搖瓶發酵中的產量31.2 g/L。這可能是因為發酵罐中溶氧充足,快速攪拌使得培養基和菌體傳質充分,最終提高了肌苷產量。這進一步證實山東1號是適合于菌株HX1026的生長與發酵生產肌苷的有機氮源。

圖3 山東1號豆粕水解液對B.subtilis HX1026發酵參數的影響Fig.3 Effect of Shandong No.1 soybean meal hydrolysate on the fermentation parameters of B.subtilis HX1026

2.7 發酵過程中肌苷晶體形態的變化

以山東1號為有機氮源,從20 L發酵罐中分別于24 h、36 h、48 h和60 h取樣,在顯微鏡下觀察肌苷晶體,結果如圖4所示。

圖4 發酵過程中肌苷晶體形態變化Fig.4 Changes of the crystal morphology of inosine during fermentation

由圖4可知,在發酵24 h時,肌苷晶體呈羽毛狀,數目比較少,晶體比較小,需在1 000倍的顯微鏡下才能看到；當發酵至36 h時,晶體呈絨毛狀,晶體變大,在400倍顯微鏡下就能被觀察到,且晶體數量明顯增多；當發酵至48 h時,晶體呈雪花狀,在400倍的顯微鏡下晶體非常清晰；當發酵至60 h時,晶體呈放射狀,數量非常多,在400倍的顯微鏡下清晰可見的肌苷晶體非常粗壯。發酵過程中肌苷晶體由小變大、由少變多的過程流暢、清晰可見,結合20 L發酵罐中肌苷產量(51.2 g/L),進一步說明山東1號是合適的菌株HX1026發酵生產肌苷的有機氮源。

3 結論

本實驗以枯草芽孢桿菌HX1026為研究對象,選擇大豆蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉和豆粕水解液為有機氮源,考察不同有機氮源對菌株HX1026發酵過程中生物量、殘糖含量、肌苷產量的影響,確定了豆粕水解液是最適合于菌株HX1026發酵生產肌苷的有機氮源；在此基礎上,研究不同廠家生產的豆粕水解液對菌株HX1026發酵過程中肌苷產量的影響,確定山東1號豆粕水解液是最適合于菌株HX1026發酵生產肌苷的有機氮源；通過20 L規模的發酵罐驗證實驗,證實山東1號豆粕水解液作為氮源時,菌株HX1026肌苷產量(51.2 g/L)大幅高于搖瓶發酵(31.2 g/L),且肌苷晶體在發酵罐中形成過程清晰可見。因此,豆粕水解液的總氮、氨基酸態氮、氨基酸態氮/總氮等技術參數可以作為肌苷大規模發酵時選擇有機氮源的標準,以確保氮源的穩定性,從而保證發酵過程中肌苷產量的穩定性,這對其他晶體類產品如鳥苷、核黃素的發酵過程中氮源的篩選也有具重要的參考價值。

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