土壤中高產蛋白酶菌株的篩選鑒定及發酵條件優化

耿 芳,楊紹青,閆巧娟,劉 軍,龔思怡,江正強*

(1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院,北京 100083；2.中國農業大學 工學院,北京 100083)

蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽鍵水解的一類酶,在食品、飼料、醫藥、化工等行業有著廣泛的應用［1］。與動、植物來源蛋白酶相比,微生物蛋白酶具有培養簡便、易批量生產等優點［2］,因此,微生物蛋白酶的研究一直備受關注。大部分商業中性和堿性蛋白酶都來源于細菌,目前,已報道產胞外蛋白酶的細菌種類很多［3］,常見的有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Aeruginosa)等。

粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens),是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌,主要存在于沿海鹽堿土壤中,能夠產生紅色非擴散性色素［4］。據報道,粘質沙雷氏菌所產的堿性蛋白酶不僅可以有效消除芽孢菌酶制劑的弊端,而且還具有一定的抗腫瘤活性［5］。趙海霞等［6］從土壤中篩選出一株產膠原蛋白酶的粘質沙雷氏菌,天然酶活為21.19 U/mL,具有較強消化牛皮的能力。WAN M等［7］從二甲基亞砜中分離出一株產耐有機試劑蛋白酶的菌株粘質沙雷氏菌MH6,該菌在一定濃度的親水有機溶劑中仍可保持穩定活性。這些研究表明粘質沙雷氏菌蛋白酶在工業應用上具有廣闊的前景。此外,粘質沙雷氏菌產生的靈菌紅素及靈桿菌脂多糖在醫藥行業有著重要的價值［8］,其作為菌種制劑又具有抑癌、抗菌等作用,在農作物的災害防治上效果顯著［9-10］。同時粘質沙雷氏菌也是一種高產脂肪酶、幾丁質酶的菌種,能夠有效降解水產品副產物［11］,具有很大的開發潛力［12］。

國外對粘質沙雷氏菌蛋白酶的研究主要集中在酶的純化與性質上。NAM M S等［13］純化得到大小約為50 kDa的堿性蛋白酶,比酶活力為289 U/mg；SALARIZADEH N等［14］在溫泉附近分離到一株產金屬蛋白酶的粘質沙雷氏菌,其在55℃、pH 10.0條件下酶活力最高；SALAMONE PR等［15］從土壤中得到的粘質沙雷氏菌來源蛋白酶,其酶活力高達865 U/mL。國內報道的野生型粘質沙雷氏菌發酵產蛋白酶的水平普遍偏低［16］,且關于粘質沙雷氏菌產蛋白酶發酵條件優化的研究較少。通常,液體發酵培養基中的一些成分如碳源、氮源等對菌株產蛋白酶很大影響［17］。本試驗從海南土壤中篩選得到一株高產蛋白酶的粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CAUH83,對菌株CAUH83形態觀察、生理生化試驗及16SrDNA序列分析,并對其產蛋白酶的發酵條件(碳源、氮源、pH、溫度、表面活性劑及發酵時間)進行優化,以期為該菌株所產蛋白酶的應用提供一定的理論基礎。同時,雖然蛋白酶的工業生產技術已經較為成熟,但為降低成本,對其進行發酵優化以提高蛋白酶活力仍然有待進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：海南火山群公園；粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)CAUH83：篩選自土壤樣品。

1.1.2 試劑

酪蛋白、Folin-酚：美國Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物：英國Oxoid公司；Triton X-100基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；r Taq DNA聚合酶：日本Takara公司；2 000bp DNA Marker：北京博邁德生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

菌種篩選固體培養基：脫脂奶粉2.0%,瓊脂2.0%。

種子培養基：酵母提取物0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖2.0%,氯化鈉0.5%,磷酸氫二鉀0.7%,磷酸二氫鉀0.3%。

菌種發酵液體培養基：酵母提取物0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖2.0%,氯化鈉0.5%,磷酸氫二鉀0.7%,磷酸二氫鉀0.3%。

培養基滅菌條件：高壓蒸汽滅菌121℃、20 min。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160全溫振蕩培養箱：江蘇太倉實驗設備廠；DK-S24恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；TU-1800PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；B104光學生物顯微鏡：上海光學儀器一廠；T100型梯度聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction,PCR)擴增儀：美國伯樂公司；JY-E型電泳儀：北京六一儀器廠；JY02G型凝膠成像儀：上海小原科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

撥開土壤表面,向下約10 cm處收集土樣。

1.3.2 產蛋白酶菌株的篩選

(1)菌株的初篩

取0.1 g土樣溶于1 mL無菌水中,稀釋10倍后取200μL混合液涂布于菌種篩選固體培養基上,于37℃靜置培養2d。

(2)菌株的復篩

挑取呈現透明圈的菌株,于菌種篩選固體培養基上37℃靜置培養2 d。經分離純化后挑取單菌落接入菌種發酵液體培養基中,于200 r/min、37℃振蕩條件下培養2 d。發酵液經離心后取上清液測定蛋白酶活力。

1.3.3 菌株的鑒定

菌株形態與生理生化鑒定：將分離純化好的菌株于篩選固體培養基上37℃靜置培養2 d,觀察該菌菌落形態。挑取單菌落涂片,經革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察細胞形態,并對該菌進行生理生化的鑒定［4］。

分子生物學鑒定：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板,采 用 16S rDNA通用引物27F(5‘-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3‘)、1492R(5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3‘),聚合酶鏈式反應擴增菌株的16SrDNA的部分基因序列。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,34次循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳驗證后,送至生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對,使用MGEA 6.0軟件中的鄰接(neighborjoining,NJ)法構建系統發育樹［18］。

1.3.4 蛋白酶活力的測定

粗酶液的制備：將單菌落接入種子培養基進行活化,取1%的種子液接種至液體培養基中,于200 r/min、37℃條件下振蕩培養2 d,發酵結束后取發酵液于10 000 r/min離心10 min,得到的上清液即為粗酶液。

蛋白酶活力的測定：采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》法。將1 mL粗酶液與1 mL底物(酪蛋白溶液)混合均勻,于40℃反應10 min,然后加入2 mL三氯乙酸終止反應,12 000 r/min條件下離心3 min。在1 mL上清液中加入5 mL Na2CO3以及1 mL Folin-酚試劑,混合均勻后于40℃保溫20 min,采用紫外可見分光光度計于波長660 nm處測定吸光度值。以先加入三氯乙酸終止反應的一組為對照組。

蛋白酶活力的定義：1個酶活力單位定義為每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量(U)。

1.3.5 粘質沙雷氏菌CAUH83發酵產蛋白酶條件優化

采用單因素試驗優化粘質沙雷氏菌CAUH83的產蛋白酶發酵條件,考察碳源、氮源、培養基初始pH值、培養溫度以及培養時間對菌株產蛋白酶的影響。

在初始發酵培養基的基礎上,考察不同碳源(酒糟、麩皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、脫脂棉和可溶性淀粉)及碳源添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%)對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶的影響?？疾觳煌?酵母提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕、大豆粉、干酪素、脫脂奶粉、尿素和硫酸銨)及氮源濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%)對產蛋白酶的影響。設計2因素(碳源、氮源濃度)3水平正交試驗,以確定產蛋白酶最佳碳氮比。調節培養基的初始pH值,考察培養基初始pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)對產蛋白酶的影響,考察不同培養溫度(20℃、25℃、30℃、32℃、35℃、40℃)對產蛋白酶的影響。最后在上述最適條件下培養該菌株,確定最適發酵時間。

1.3.6 聚丙烯酰氨凝膠電泳及酶譜分析

參照LAEMMLIUK［19］的方法,將粗酶液與含有十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulfate,SDS)和二巰蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)的緩沖液混合均勻后于沸水中加熱5min,冷卻離心后上樣,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測蛋白酶純度,并計算其分子質量。

蛋白酶酶譜：參照JIANGWB等［20］的方法。在電泳分離膠中加入0.1%的明膠作為底物,在含有2.5%Triton X-100的50mmol/LTris-HCl緩沖液中反應30min后,置于50mmol/L Tris-HCl緩沖液中,37℃反應2 h。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選、分離和鑒定

2.1.1 蛋白酶產生菌的篩選結果

從不同土壤中篩選獲得多株產蛋白酶的菌株,測定其蛋白酶活,結果見表1。由表1可知,通過比較這幾株菌的菌落直徑、水解圈比值以及發酵液的酶活力,篩選出一株高產蛋白酶菌株CAUH83,該菌株初篩蛋白酶活力達到126U/mL。

表1 蛋白酶產生菌的篩選結果Table 1 Screening results of protease-producing strains

2.1.2 形態學觀察及生理生化鑒定結果

根據菌株CAUH83的菌落形態、革蘭氏染色以及生理生化反應結果,按《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步分類［21］,該菌產紅色菌落,菌落表面光滑,邊緣不規則,不透明,且粘性易挑起(見圖1),菌落形態與趙海霞等［6］報道的產膠原蛋白酶的沙雷氏菌(Serratiamarcescens)描述一致。

根據分離菌的菌落和菌體形態、革蘭氏染色以及生理生化反應,按《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步分類［19］,生理生化特征見表2。由表2可知,菌株革蘭氏染色、產芽孢、精氨酸雙水解酶及葡萄糖、木糖、棉子糖、阿拉伯糖利用試驗結果呈陰性；脂酶、DNA酶、明膠液化及蔗糖、乳糖利用試驗結果呈陽性。

圖1 菌株CAUH83菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strain CAUH83

表2 菌株CAUH83生理生化特性鑒定結果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics of strain CAUH83

2.1.3 分子生物學鑒定

圖2 菌株CAUH83基于16s rDNA基因序列系統發育樹Fig.2 Pylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain CAUH83

提取菌株CAUH83的基因組DNA,經PCR擴增、測序后得到全長約1500bp的基因序列,在美國國家生物技術信息中心(ntional center of biotechnology information,NCBI)數據庫中進行基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對可知,該菌株序列與粘質沙雷氏菌的16SrDNA序列同源性高達99%。利用軟件MEGA 6.0構建系統發育樹,結果見圖2。由圖2可知,該菌株CAUH83與粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)聚于一支,親緣關系最為接近。因此結合形態學、生理生化鑒定結果,鑒定菌株CAUH83為一株粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

2.2 菌株CAUH83發酵產蛋白酶條件優化

2.2.1 碳源對菌株CAUH83產蛋白酶的影響

不同碳源(含量2%)對菌株CAUH83發酵產酶的影響結果見圖3。由圖3可知,當以蔗糖作為碳源時,菌株CAUH83發酵產蛋白酶活性最高,蛋白酶活力為162.9 U/mL,其次為葡萄糖(159.6 U/mL)和可溶性淀粉(126.3 U/mL)。發酵過程中,蔗糖先分解為葡萄糖和果糖。果糖可以直接轉化為1,6-二磷酸果糖,進入糖酵解過程。因此,相對于葡萄糖,果糖更易代謝,能夠更加有效地提高菌體量［22］。因此,選擇蔗糖作為最適碳源。

圖3 不同碳源對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effects of different carbon resources on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

圖4 蔗糖添加量對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effects of sucrose addition on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

以蔗糖為碳源,研究不同蔗糖添加量對菌株產酶的影響結果見圖4。由圖4可知,蔗糖添加量對產酶的影響較為明顯,蔗糖添加量由1%增加到3%時,酶活逐漸升高,當蔗糖添加量為3%時,蛋白酶的酶活力最高為238.8 U/mL,繼續增加蔗糖添加量時,酶活力呈緩慢下降趨勢。因此選擇3%作為蔗糖的最適添加量。

2.2.2 氮源對菌株CAUH83產蛋白酶的影響

不同氮源(含量2%)對菌株產蛋白酶的影響結果見圖5。由圖5可知,氮源對菌株CAUH83產酶的影響大于碳源［23］,有機氮源更有利于菌株產酶,以大豆粉作為氮源時,蛋白酶的酶活力最高為378.4U/mL,其次為脫脂奶粉與豆粕。從營養成分來看,大豆粉蛋白質含量高達40%,并且為優質蛋白。此外,大豆粉還富含各種氨基酸、礦物質和維生素等營養成分。因此,選擇大豆粉為最適氮源。

圖5 不同氮源對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effects of different nitrogen resources on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

確定大豆粉為最適氮源后,進一步研究大豆粉的添加量對菌株產蛋白酶的影響,結果見圖6。由圖6可知,當大豆粉添加量為3%時,蛋白酶酶活力最高,當大豆粉的含量繼續增加時,酶活力開始逐漸下降。因此,大豆粉最適添加量為3%。

圖6 大豆粉添加量對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶的影響Fig.6 Effects of soybean flour addition on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.2.3 培養基初始pH值對菌株CAUH83產蛋白酶的影響

液體發酵培養基不同初始pH值對粘質沙雷氏菌CAUH83產酶的影響結果見圖7。由圖7可知,隨著初始pH值升高,酶活力逐漸增大；當初始pH值＞6時,酶活力開始下降。故該菌產酶最適初始pH值為6。中性偏酸環境更適宜該菌株產蛋白酶,與文獻報道一致［24］。

圖7 培養基初始pH值對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.7 Effects of initial pH on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.2.4 培養溫度對菌株CAUH83產蛋白酶的影響

培養溫度對菌株CAUH83產蛋白酶的影響結果見圖8。由圖8可知,培養溫度對菌株CAUH83發酵產蛋白酶的影響較大。當菌株在30℃培養時,蛋白酶活性最高,達到1 862.2 U/mL。當培養溫度繼續升高時,酶活力迅速下降,因此,選擇30℃作為發酵培養基的培養溫度。

圖8 培養溫度對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.8 Effects of incubation temperature on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

郝林華等［26］研究粘質沙雷氏菌的生長溫度時發現,高溫對該菌的生長非常不利,在26～30℃時該菌生長效果最好,高于30℃時該菌的耐受性下降,產菌量也偏低。菌株CAUH83最適培養溫度為30℃,且培養溫度對該菌分泌蛋白酶的影響較為顯著。受溫度影響較大的還有假單胞菌Pseudomonas sp.W7,康傳紅等［27］在優化該菌產低溫蛋白酶的發酵條件時發現,在20℃時該酶蛋白酶活力達到最大值,繼續升高培養溫度,酶活力逐漸下降,溫度升至30℃時,酶活力僅為最大酶活力的15%。

2.2.5 培養時間對菌株CAUH83產蛋白酶的影響

確定以上最適條件后,進一步考察發酵時間對粘質沙雷氏菌CAUH83發酵產蛋白酶的影響結果見圖9所示。由圖9可知,菌株CAUH83在優化后的最適發酵條件下,12h已開始產酶,發酵48 h時酶活力達到最高水平,之后繼續延長培養時間,酶活力逐漸下降。因此,最佳培養時間為48 h。

圖9 培養時間對粘質沙雷氏菌CAUH83產蛋白酶酶活的影響Fig.9 Effects of incubation time on protease activities produced by S.marcescens CAUH83

2.3 SDS-PAGE及酶譜分析

粘質沙雷氏菌CAUH83在最適條件下培養48 h,其粗酶液的SDS-PAGE及蛋白酶酶譜如圖10所示。由圖10可知,菌株CAUH83分泌的主要蛋白分子質量約為50 kDa。酶譜結果表明,該酶為蛋白酶。作為野生菌株,菌株CAUH83的發酵粗酶液中蛋白質組分相對簡單,SDS-PAGE電泳條帶接近單一,這一特征有利于該酶的純化。

圖10 粘質沙雷氏菌CAUH83發酵液SDS-PAGE電泳圖譜及酶譜圖Fig.10 SDS-PAGE electrophoretogram and zymogram of fermentation liquid from S.marcescens CAUH83

3 結論

本研究從海南土壤樣品中篩選得到一株高產蛋白酶的粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。采用單因素試驗優化得到了該菌株液體發酵產蛋白酶的最優條件為：蔗糖添加量30%、大豆粉添加量30%、初始pH值6.0、培養溫度30℃、培養時間48 h。在此發酵條件下,蛋白酶的酶活力達到1 932.3 U/mL,較優化之前提高了15.3倍,為目前已報道野生型粘質沙雷氏菌產蛋白酶的最高水平。SDS-PAGE及酶譜分析表明,該菌所產的蛋白酶具有蛋白酶活性且蛋白質分子質量約50 kDa。本研究通過研究高產蛋白酶菌株粘質沙雷氏菌的發酵條件,為進一步研究其產酶特性以及在工業領域的應用提供理論依據。

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