灰樹花液態深層發酵條件研究

李炳功,耿偉濤,趙琰明,王金菊,王艷萍*

(1.天津科技大學 新農村發展研究院,天津 300457；2.河南中沃實業有限公司,河南 濟源 459000)

灰樹花(Grifolafrondasa),又稱貝葉多孔菌,栗子蘑,蓮花菇,千佛菌,日本稱之為舞蘑,美國稱之為林雞,隸屬于擔子菌亞門層菌綱多孔菌科樹花菌屬。其外觀為灰白色,其形如卷心菜,婀娜如云,其肉質脆嫩,其味如雞絲,且芬芳誘人,具有獨特香氣,被譽為“食用菌王子”［1］。子實體呈蓮花形,其分支形似菜花,重疊叢生,菌蓋為扇形,菌肉呈軟木質,孢子呈卵白色［2］。中國預防醫學科學院營養等研究機構分析得出,灰樹花干品中蛋白質含量31.5%,包含18種氨基酸,占總蛋白含量的23.53%,其中8種氨基酸必需氨基酸占總氨基酸的38.5%,所以灰樹花可以與其他食物進行蛋白質互補［3］；脂肪3.2%；膳食纖維33.7%；碳水化合物21.4%；灰分5.1%；富含鋅、鐵、鈣等多種人體所需元素；維生素含量豐富,其中維生素B11.47 mg/100 mg、維生素B20.72 mg/100 mg、維生素E 109.7 mg/100 mg、維生素C 17.0 mg/100 mg,胡蘿卜素4.5 mg/100 mg［4］。此外,灰樹花還含有多酚［5］和多糖［6］等活性物質,其中灰樹花多糖被實驗驗證具有抗腫瘤［7］、提高免疫力［8-9］、抗病毒［10］、降低血壓［11］等生理活性功能。

長期以來,灰樹花都是通過固體栽培生產,但是固體栽培生產存在生長周期長,占地面積大,易受季候影響［12］等問題,大大制約了灰樹花的開發利用。而采用液體深層培養灰樹花的方法,可以在短時間內生產大量菌絲體和代謝產物,且易于控制培養環境的理化條件,便于工業化生產。因此,國內外的研究人員對液態發酵培養灰樹花的條件進行了研究,如季宏更等［13］發現灰樹花最佳培養條件為接種量10%,攪拌速度140 r/min,培養溫度26℃；LEEB C等［14］發現灰樹花最佳培養條件為通氣量1.16 L/min,攪拌速度166 r/min。此外,研究人員發現其他條件也可以影響灰樹花的生長,如李心怡等［15］研究發現交變磁場可以促進灰樹花的生長。本研究以灰樹花菌絲體生物量和多糖含量為評價指標,優化灰樹花液態深層發酵條件,探討發酵類型對灰樹花生長的影響,并實現擴大培養,以期為灰樹花的綜合開發應用和工業化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

灰樹花(Grifolafrondasa)：本實驗室保藏,編號為CGMCC No.14358。

1.1.2 試劑

沒食子酸(分析純)：北京化學試劑公司；牛血清白蛋白(純度98%)：上海藍季科技發展有限公司；苯酚、Na2HPO4·12H2O(均為分析純)：天津市四通化工廠；NaH2PO4·2H2O(分析純)：天津大學科威公司；葡萄糖(分析純)：河南永昌飛天淀粉糖有限公司；蛋白胨(分析純)：安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉(分析純)：鄭州超凡化工有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂(均為分析純)：江蘇科倫多食品配料有限公司；硫酸(分析純)：廊坊市金海化工有限公司；鹽酸(分析純)：北京化工廠。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基［16］：馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然。

PDA平板培養基［17］：馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 1 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然。

液體種子培養基［6］：馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 1 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然。

液體發酵培養基：葡萄糖22g,蛋白胨3g,KH2PO41.2g,MgSO4·7H2O 0.8 g,維生素B11.2 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然。

補料發酵培養基：與液體發酵培養基相同。

以上所有培養基滅菌條件：高壓蒸汽滅菌,115℃、20 min。

1.2 儀器與設備

MA300A型磁力攪拌器：日本YAMATO公司；BIOTECH-5BGZ型氣升式發酵罐、BIOTECH-10JGZ型氣升式發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；JA2003型電子分析天平：上海精科天平廠；722E可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；SM-510型全自動滅菌鍋：日本YAMATO公司；5415D型離心機：德國EPPENDORF公司；SPX-250A型恒溫培養箱：上海煜南儀器有限公司；BS-2F型振蕩培養箱：金壇市梅香儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化［18］

用接種鏟挖取保存在PDA斜面上的直徑為1 cm的灰樹花菌絲體塊接種到新的PDA斜面試管中,于25℃恒溫培養20～25 d,待菌絲滿管,保存于4℃冰箱保存備用。

用直徑為1 cm的打孔器將之前活化的菌種接種于PDA平板培養基中央,于25℃恒溫培養20～25 d,待菌絲長滿平板后接種。

1.3.2 搖瓶種子培養

用直徑為1 cm的打孔器,從平板上取10個大小相同的菌絲體塊接入裝液量為100 mL/500 mL搖瓶種子培養基中,于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養4.5 d。

1.3.3 發酵條件優化

(1)攪拌速度優化：選擇7 L攪拌式發酵罐,培養溫度25℃,通氣量2L/min,分別在攪拌速度為100r/min、120r/min、140 r/min條件下培養14 d,根據菌絲體生物量和發酵液中多糖含量確定最佳的攪拌速度。

(2)培養溫度優化：在最優攪拌速度條件下,選擇7 L攪拌式發酵罐,通氣量2 L/min,分別在培養溫度為23℃、25℃、27℃條件下培養14 d,根據菌絲體生物量和發酵液中多糖含量確定最佳的培養溫度。

(3)通氣量優化：在最優攪拌速度和培養溫度條件下,選擇7 L攪拌式發酵罐,分別在通氣量為2 L/min、3 L/min、5L/min的條件下培養14 d,根據菌絲體生物量和發酵液中多糖含量確定最佳的通氣量。

1.3.4 不同發酵罐類型對灰樹花的影響

分別采用7 L攪拌式發酵罐和氣升式發酵罐連接溶氧電極、pH電極、通氣裝置及攪拌裝置,裝液量5 L/7 L,按接種量10%接種于發酵罐中,于上述最佳條件下培養,每天取樣50 mL分析,考察不同發酵罐類型對灰樹花的影響。

1.3.5 灰樹花的擴大培養

選取最優的發酵罐類型,將50 L的發酵罐連接溶氧電極、pH電極、通氣裝置及攪拌裝置,裝液量30 L/50 L,將培養到10 d的7 L攪拌式發酵罐中的發酵液作為種子液接種,接種量10%,在攪拌速度100r/min、溫度23℃、通氣量15L/min條件下培養,每天取樣50 mL分析。

1.3.6 菌絲體生長情況測定

菌絲體生物量：將發酵液在4℃條件下10 000 r/min離心20 min,收集上清液和沉淀。將沉淀用無菌水洗滌3次,于真空冷凍干燥機中凍干至恒質量,取出稱質量,減去濾紙質量,即為菌絲體生物量［19］。

菌絲球直徑：隨機取10個菌絲球置于90 mm培養皿中緊密的排成一排,用游標卡尺測量其總直徑,算出菌絲球平均直徑［20］。

1.3.7 灰樹花發酵液中多糖含量及殘糖量的測定

取10 mL上述離心得到的上清液置于截留分子質量為8 000 Da的透析袋中流水透析,直至透析液中無單糖檢測出為止,然后采用苯酚-硫酸法［21］測定其多糖含量。

取1mL上述離心得到的上清液,采用3,4-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法［22］測定灰樹花發酵液中的殘糖量。

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化結果

2.1.1 攪拌速度對灰樹花液態深層發酵的影響

攪拌是食用菌發酵過程中的一個重要因素,適宜的攪拌速度不僅可以充分混合培養液使菌絲處于理想的培養環境中,也可以增加培養基中的溶氧量。攪拌速度對灰樹花液態深層發酵的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著攪拌速度的增加,灰樹花菌絲體的生物量呈現先增加后降低的趨勢,在攪拌速度為120 r/min時,菌絲體生物量達到最大為(3.983±0.371)g/L,而發酵液中多糖含量卻呈現不斷下降的趨勢,在攪拌速度為100 r/min時多糖含量最大為(0.291±0.033)g/L,分析原因可能是由于高攪拌速度時,剪切力較大,菌絲易被打斷,影響了菌絲的活性和多糖的積累,所以后續實驗將采用120 r/min作為最佳的攪拌速度。

圖1 攪拌速度對灰樹花液態深層發酵的影響Fig.1 Effect of stirring speed on liquid submerged fermentation of G.frondasa

2.1.2 培養溫度對灰樹花液態深層發酵的影響

圖2 培養溫度對灰樹花液態深層發酵的影響Fig.2 Effect of culture temperature on liquid submerged fermentation of G.frondasa

溫度是影響菌絲生長的最重要條件,食用菌適宜的生長溫度在22～30℃之間,不同的菌種的最適生長溫度不同。培養溫度對灰樹花液態深層發酵的影響結果見圖2。由圖2可知,隨著培養溫度的升高,灰樹花菌絲體生物量和發酵液中多糖的含量逐漸降低,當培養溫度為23℃時,灰樹花菌絲體生物量和發酵液中多糖含量達到最大,分別為(4.537±0.364)g/L和(0.486±0.022)g/L,所以23 ℃為最佳的培養溫度。

2.1.3 通氣量對灰樹花液態發酵的影響

在需氧型微生物發酵中,微生物對培養基中的溶氧量非常敏感,在發酵過程中通入空氣可以供給細胞生長所需的O2,同時也有利于除去代謝過程中產生的廢氣。通氣量對灰樹花液態深層發酵的影響結果見圖3。由圖3可知,隨著通氣量的增加,灰樹花的菌絲體生物量和發酵液中多糖含量也隨之增加,當通氣量為5 L/min時達到最大,分別為(5.805±0.259)g/L和(0.513±0.026)g/L,但考慮到通氣量較高時,發酵液劇烈翻騰,有大量的泡沫產生,影響發酵罐的裝液量,同時也會增加染菌的幾率,所以選擇通氣量3 L/min為灰樹花液態深層發酵的最佳通氣量。

圖3 通氣量對灰樹花液態深層發酵的影響Fig.3 Effect of ventilatory capacity on liquid submerged fermentation of G.frondasa

2.2 兩種不同類型發酵罐對灰樹花液態深層發酵的影響

目前,攪拌式發酵罐和氣升式發酵罐是工業化生產中兩種主要的發酵設備,本研究在相同的培養條件(攪拌速度120 r/min、培養溫度23℃、通氣量3 L/min、接種量10%)下,采用7L的這兩種發酵罐分別液態深層發酵灰樹花14d,每隔1 d取樣檢測,攪拌式發酵罐和氣升式發酵罐對灰樹花液態深層發酵過程中殘糖量、溶氧量、pH、生物和多糖含量的影響結果見圖4。

由圖4可知,采用攪拌式發酵罐發酵時,灰樹花的適應期較短為3 d,對數期較長為7 d,而氣升式發酵罐發酵時,灰樹花的適應期和對數期分別是5d和5d,說明攪拌產生有利于灰樹花菌絲的分散,從而提高了發酵液中菌絲的濃度,延長數生長期促進了灰樹花菌絲體的生長和胞外胞外多糖的合成。在衰亡期階段,攪拌式發酵培養的灰樹花生物量和發酵液中多糖含量分別為10.742 g/L和3.541 g/L,高于氣升式發酵罐中生物量(4.802 g/L)和發酵液中多糖含量(1.048 g/L)。采用攪拌式發酵罐和氣升式發酵罐對灰樹花液態深層發酵14 d時的菌絲體形態見圖5。采用攪拌式發酵罐發酵灰樹花14 d時,菌絲球直徑為(2.725±0.372 mm),菌絲球密度為(306個/10 mL),而采用氣升式發酵罐發酵灰樹花14 d時,菌絲球直徑為(3.225±0.571 mm),菌絲球密度為130個/10 mL),采用攪拌式發酵罐發酵灰樹花菌絲球直徑較小,密度大,且更加均勻。此外,采用攪拌式發酵罐發酵灰樹花發酵液菇香味更加濃郁。綜上得出攪拌式發酵罐比氣升式發酵罐更適用于灰樹花液態深層發酵。

圖4 7 L攪拌式(A)及氣升式(B)發酵罐液態深層發酵灰樹花的動力學曲線Fig.4 Kinetic curves of liquid submerged fermentation of G.frondasa in stirring(A)and airlift(B)7 L fermenter

圖5 7 L攪拌式(A)及氣升式(B)發酵罐液態深層發酵灰樹花的菌絲體形態Fig.5 Mycelium morphology of liquid submerged fermentation of G.frondasa in stirring(A)and airlift(B)7 L fermenter

2.3 攪拌式發酵罐擴大培養灰樹花

在得到7 L攪拌式發酵罐液態深層發酵灰樹花的最佳條件后,在50L攪拌式發酵罐中進行擴大培養,結果見圖6。

圖6 50 L攪拌式發酵罐液態深層發酵灰樹花的動力學曲線Fig.6 Dynamic curve of submerged fermentation of G.frondasa in 50 L stirred tank fermenter

在攪拌速度100r/min、培養溫度23℃、通氣量15 L/min,接種量10%的條件下發酵14 d,由圖6可知,灰樹花發酵培養13 d時生物量和發酵液中多糖含量達到最大值,分別為13.238g/L和3.178g/L,發酵液的pH值從4.64降為3.58,溶氧量降為27.5%,并且發酵液中的殘糖量由22 g/L降為3.357 g/L。表明50 L攪拌式發酵罐擴大培養灰樹花取得了成功。

3 結論

通過對攪拌轉速、培養溫度和通氣量的研究得出灰樹花在7 L攪拌式發酵罐中的最佳液態深層發酵條件為攪拌速度120 r/min、培養溫度23℃和通氣量3 L/min；同時,通過對比兩種不同類型的發酵罐發現,采用攪拌式發酵罐液態深層發酵灰樹花14 d時,生物量和發酵液中多糖含量更高,分別為10.742 g/L和3.541 g/L,菌絲球形態更好且密度較高,發酵液菇香味更加濃郁,所以攪拌式發酵罐更適用于灰樹花液態深層發酵；此外,本研究成功的在50 L攪拌式發酵罐中進行了擴大培養,發酵14 d時,灰樹花的生物量和發酵液中多糖含量分別達到13.238 g/L和3.178 g/L。本研究結果為灰樹花的工業化液態培養提供了一定的理論基礎和技術支持。

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