一株凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發酵培養基的優化

董佩佩,汪祥燕,劉元香,辛國芹*,徐海燕,谷 巍,鄭軍紅,陳梅楠

(1.山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東 泰安 271000；2.山東省泰安市植物保護站,山東 泰安 271000)

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一類可以形成芽孢同時又產乳酸的細菌［1］,其除了具有一般乳酸菌的產酸、可調節動物腸道健康、提高消化能力和提高免疫力的益生性能外［2］,還具有芽孢菌耐高溫、耐膽鹽、耐酸等抗逆性［3-5］,被美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)和美國飼料控制官員協會列入可用于飼料的安全微生物菌種名單［6］,廣泛地應用于醫藥［7］、畜禽［8-10］和水產［11-12］等行業。芽孢無新陳代謝,能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等,所以該芽孢桿菌制成的菌劑是較為理想的微生物制劑［13］。由于最終制成的菌劑要有芽孢的形式才具有高抗性,所以如何獲得高活性高濃度的芽孢是制約凝結芽孢桿菌制劑生產的關鍵因素［14］,且發酵凝結芽孢桿菌的培養基配方又是進行后續生產的重要條件。

目前,對于凝結芽孢桿菌的研究重點在于如何用低廉易獲得的培養基獲得高濃度的凝結芽孢桿菌芽孢。路程等［15］對凝結芽孢桿菌T50進行產芽孢條件優化,確定培養基組成為蛋白胨2%,葡萄糖0.2%,酵母浸粉0.3%,麩皮5%；培養基初始pH 7.0,接種量2%,培養時間3 d,最終使芽孢形成率達到94.3%,但對發酵終點活菌數沒有體現。吳逸飛等［16］對一株凝結芽孢桿菌的培養基原料及接種量、通氣量等培養條件進行優化,最終獲得芽孢數為3.5×108CFU/mL。孫麗娜等［17］通過發酵罐分批補料的方式得到凝結芽孢桿菌13002發酵終點活菌總數為3.095×109CFU/mL,最終凍干后達0.730×1011CFU/g。培養時間長,不易產孢,培養基及后處理工藝成本較高是制約凝結芽孢桿菌規模化生產的主要原因。

因此,該研究通過單因素試驗對菌株碳氮源及無機鹽進行篩選,Plackett-Burman(PB)試驗對影響因子進行考察和評價,然后對關鍵影響因素進行最陡爬路徑試驗,進一步采用響應面法研究和探討其交互作用,獲得最佳發酵培養基組成,為其產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)(菌種保藏號BLCC1-0517)：山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

斜面培養基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂15 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

種子培養基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基［19］：可溶性淀粉10 g/L,豆粕5 g/L,硫酸錳0.34 g/L,pH 7.0,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：江蘇通凈凈化設備有限公司；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；OLYMPUSCX31型顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；DPH-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵方法及培養條件

菌種活化：將實驗室保藏的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)用斜面培養基活化,恒溫培養箱中42℃培養48h。

種子培養：將活化好的凝結芽孢桿菌(B.coagulans)接種到種子液體培養基中,于42℃、180 r/min條件下搖床培養24 h,獲得液體種子。

發酵培養：向基礎發酵培養基中接入2%的種子液,于42℃、180 r/min條件下搖床培養48 h。

1.3.2 菌體數及芽孢數檢測

菌體數測定：發酵液取樣,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,傾注法檢測含菌量,重復3次。

芽孢數測定：取5 mL發酵液,80℃水浴熱處理10 min,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,傾注法檢測芽孢的形成量,重復3次。

1.3.3 培養基優化單因素試驗

碳源的確定：將基礎發酵培養基中碳源分別用玉米淀粉、玉米面、麩皮、麥芽糊精、葡萄糖、蔗糖、低聚異麥芽糖、可溶性淀粉替換,添加量為1.0%,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180r/min條件下培養48 h,檢測發酵液中的芽孢數,考察不同的碳源對菌株芽孢的形成量的影響。

氮源的確定：將基礎發酵培養基中氮源分別用豆粕、蛋白胨、尿素、酵母膏、牛肉膏替換,添加量為0.5%,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養48 h,檢測發酵液中的芽孢數,考察不同的氮源對菌株芽孢的形成量的影響。

無機鹽的確定：去掉基礎發酵培養基中的無機鹽,分別添加0.002 mol/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碳酸鈣和硝酸鈉,以不加任何無機鹽的發酵培養基作對照,其他成分不變。接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養48 h,檢測發酵液中的芽孢數,考察不同的無機鹽對菌株芽孢的形成量的影響。

1.3.4 培養基優化響應面試驗

(1)Plackett-Burman試驗設計

根據碳氮源單因素篩選試驗及無機鹽單因素試驗結果,采用N=12的Plackett-Burman(PB)設計,把每個因素設計成高(+1)和低(-1)2個水平,對凝結芽孢桿菌發酵液中的芽孢數進行響應。根據單因素試驗結果,確定麩皮(A)、牛肉膏(B)、硫酸鎂(C)、硫酸錳(D)、磷酸二氫鈉(E)這5個因素為PB試驗的考察對象。根據PB試驗設計方案配制培養基,接種量為2%,裝液量為10%,置于42℃、180 r/min條件下培養48 h。PB試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

(2)最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向,以快速逼近最佳區域。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小確定,正效應的因素均取較高值,負效應的因素均取較低值。

(3)響應面分析試驗方法

根據最陡爬坡試驗結果,顯著因素以中心點為零水平,高水平和低水平分別比零水平高于或低于一個實際步長。采用Design Expert version 8.0.5軟件中心組合試驗設計(central compositedesign,CCD)進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響

圖1 不同碳源對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the spore number of B.coagulans

不同碳源對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響見圖1。由圖1可知,麩皮作為唯一碳源時,發酵液中的芽孢數最多,達到1.03×108CFU/mL,其次是低聚異麥芽糖,芽孢數為8.53×107CFU/mL。葡萄糖作為單一碳源時,芽孢最少,芽孢數為5.01×106CFU/mL。綜合成本及芽孢數情況,選擇麩皮為后續研究的碳源。

2.2 不同氮源對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響

不同氮源對芽孢數的影響見圖2。由圖2可知,牛肉膏作為氮源時發酵液中芽孢數最高,為1.01×108CFU/mL,其次是豆粕,發酵液芽孢數為8.86×107CFU/mL。蛋白胨和尿素作為氮源時,芽孢數較少,分別為2.23×107CFU/mL和1.17×107CFU/mL。所以選擇牛肉膏作為后續試驗的氮源。

圖2 不同氮源對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the spore number of B.coagulans

2.3 不同無機鹽對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響

不同無機鹽對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響結果見圖3。由圖3可知,添加硫酸錳、硫酸鎂和磷酸二氫鈉時,發酵液芽孢數分別為9.70×107CFU/mL、1.19×108CFU/mL、8.93×107CFU/mL,均高于對照組芽孢數5.80×107CFU/mL。所以選擇硫酸錳、硫酸鎂和磷酸二氫鈉作為無機鹽。

圖3 不同無機鹽對凝結芽孢桿菌芽孢數的影響Fig.3 Effects of different inorganic salts on the spore number of B.coagulans

2.4 Plackett-Burman試驗結果

按PB試驗設計進行試驗,把每個因素設計成高(+1)和低(-1)2個水平,高水平是低水平的1.5倍。PB試驗設計及響應值結果見表2,各因素水平及顯著性分析見表3。

表2 PB試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3分析結果可知,麩皮和牛肉膏為正效應,硫酸鎂、硫酸錳、磷酸二氫鈉為負效應。從P值來看,可信度＞95%的因素為麩皮和牛肉膏,影響顯著(P＜0.05)；其他因素在α=0.05水平上對芽孢數影響不顯著(P＞0.05)。確定麩皮和牛肉膏作為主要影響因素進行下一步試驗。

表3 Plackett-Burman試驗因素效應分析Table 3 Effect analysis of factors of Plackett-Burman experiments

2.5 最陡爬坡試驗

根據表3分析結果,顯著因素的變化步長及方向的試驗設計及結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

由表4可知,第3組試驗麩皮30.0 g/L,牛肉膏15 g/L時凝結芽孢桿菌發酵液中芽孢數最高,為25.65×107CFU/mL。故采用麩皮30.0 g/L,牛肉膏15.0 g/L為后續響應面試驗的中心點。

2.6 響應面分析的試驗設計及結果

根據最陡爬坡試驗確定了重要影響因素的取值區間。利用Design Expert version 8.0.5進行中心組合的試驗設計,對凝結芽孢桿菌培養基中的關鍵因素做進一步的研究和探討。以麩皮和牛肉膏為自變量,以凝結芽孢桿菌芽孢數(Y)為響應值,進行2因素5水平的中心復合設計試驗,試驗因素與水平見表5,設計及結果見表6,回歸模型方差分析結果見表7。

表5 中心組合試驗設計因素與水平Table 5 Factors and levels of central composite experiments design

表6 中心組合試驗設計及結果Table 6 Design and results of central composite experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根據表6試驗結果通過Design-Expert軟件進行響應面分析,建立多元二次回歸方程如下：Y=31.68+2.64A+0.47B+1.32AB-12.69A2-13.05B2

由表7可知,模型P=0.016 1＜0.05,表明模型對響應值Y的影響顯著,可信度較高；模型的二次項對凝結芽孢桿菌芽孢數的效應影響極顯著(P＜0.01)；模型失擬項的P值為0.910 2,影響不顯著(P＞0.05),表明多元回歸方程具有顯著性,模型能對凝結芽孢桿菌產芽孢數進行較好的分析和預測。

2.7 最適培養基組成的確定及驗證試驗

根據上述回歸方程繪出響應面分析圖,以確認麩皮和牛肉膏對凝結芽孢桿菌產芽孢數的影響,響應面圖見圖4。

圖4 麩皮與牛肉膏交互作用對芽孢數影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between bran and beef extract on spore number

由圖4可知,該方程的拋物線圖形開口向下,說明方程存在最大值,即響應面范圍覆蓋了最大值所在的區域。由Design Expert version 8.0.5軟件分析得到最適培養基中麩皮和牛肉膏對應的實際值分別為32.12g/L和15.24g/L。由此可知,最適培養基組成為麩皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸鎂0.49 g/L,硫酸錳0.34 g/L,磷酸二氫鈉0.31 g/L。預測在此組成條件下發酵凝結芽孢桿菌(B.coagulans)芽孢數最高,理論值為3.18×108CFU/mL。

使用最優培養基進行凝結芽孢桿菌(B.coagulans)驗證試驗,實際芽孢數為3.38×108CFU/mL,略高于預測結果,說明響應面優化試驗結果可靠。

3 結論

經過單因素試驗與響應面設計分析,確定凝結芽孢桿菌(B.coagulans)的最優發酵培養基配方為麩皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸鎂0.49 g/L,硫酸錳0.34 g/L,磷酸二氫鈉0.31 g/L。在此配方條件下發酵凝結芽孢桿菌,芽孢數達到3.38×108CFU/mL,是優化前的5.28倍。

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