白酒生產用己酸菌發酵液發酵條件及培養基組成的優化

胡智慧,諶柄旭,任 雪,郭學武,肖冬光*

(天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

濃香型白酒是目前我國產量最大、消費面最廣、研究最多的一類白酒,其質量的好壞與窖泥的質量關系密切［1］。窖泥是己酸菌生長、繁殖和代謝產己酸的場所,所產己酸在大曲酯化酶的作用下與乙醇發生酯化反應,形成濃香型白酒的主體香成分—己酸乙酯,其含量影響著濃香型白酒的風格與質量。

窖泥經過一段時間的使用后,就會出現退化現象,如表面析出淺白色或針狀結晶物質,致使濃香型白酒中的己酸乙酯含量降低,嚴重影響白酒的風味及口感［2］。目前科研工作者已采取使用超濃縮復合己酸菌液［3-5］、固(液)窖泥功能菌［6-9］、人工窖泥［10-13］等多種方法修復老化窖泥,來彌補窖泥退化帶來的不良后果。

濃香型白酒的生產多使用小窖池作為發酵容器,雖然酒的品質好,但很大程度上限制了糟醅出入窖池的方式,降低了勞動效率,增加了勞動強度及生產成本,給濃香型白酒的機械化生產帶來了很多的困難。隨著大窖池和機械抓斗的應用,極大地提高了勞動效率,但同時也影響了白酒的品質,主要是因為大窖池窖泥中的己酸菌所產的己酸很難滲透到窖池中部,致使窖池中部很難形成己酸乙酯。高濃度己酸菌發酵液的灌窖可以有效地解決大窖池中部己酸乙酯合成不足的問題,進而改善和提高白酒的品質。

己酸菌發酵液已廣泛應用于濃香型白酒的生產中,如可以應用于濃香型白酒的灌窖［14-15］,增加窖池中己酸的濃度,為己酸乙酯的合成提供充足的前體物；也可以用于窖池保養［15-16］、人工窖泥培養［17］,修復改善窖泥微生態菌群,增加窖泥的活力；還可以應用于濃香型白酒的酯化液制作［18-19］,直接添加到窖池中或者串蒸酒醅,達到提高濃香型白酒中己酸乙酯含量的目的。如何快速地提高己酸菌發酵液中己酸的含量,滿足濃香型白酒生產的需求,節約生產成本,是亟需解決的問題之一。本研究采用單因素試驗和響應面法對影響己酸菌代謝產酸的發酵條件和培養基組成進行了優化,旨在探索出己酸菌發酵液的最佳生產工藝,為其工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

己酸菌：從濃香型白酒的窖泥中篩選得到；硫酸銨、磷酸氫二鉀、乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；乙酸鈉、碳酸鈣、硫酸鎂：天津市化學試劑一廠；酵母浸粉(生化試劑)：北京奧博星生物技術公司；生物素：北京索萊寶科技有限公司；對氨基苯甲酸：上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純；己酸標準品(色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司。

種子培養基［20］：乙酸鈉0.5g/100mL,硫酸銨0.05g/100mL,磷酸氫二鉀0.04 g/100 mL,硫酸鎂0.02 g/100 mL,酵母浸粉0.2 g/100mL,自然值pH,121℃滅菌20 min。干熱滅菌后接種前加入1g/100mL碳酸鈣,過濾除菌后加入2.5mL/100mL體積分數95%乙醇溶液。

發酵培養基：乙酸鈉0.5g/100mL,硫酸銨0.05g/100mL,磷酸氫二鉀0.04 g/100mL,硫酸鎂0.02 g/100 mL,酵母浸粉0.2g/100mL,自然pH值,121℃滅菌20 min。干熱滅菌后接種前加入1g/100 mL碳酸鈣,過濾除菌后加入0.05 g/100mL對氨基苯甲酸、0.05 g/100 mL生物素和2.5 mL/100 mL體積分數95%乙醇溶液。

1.2 儀器與設備

LRh-250A型生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀：美國Agilent公司；UV-1200紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 己酸菌種子培養周期的確定

取100μL己酸菌接入含有5 mL種子培養基的試管中,35℃,200 r/min活化培養12 h。活化種子液按10%的接種量接入裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中,35℃、200 r/min培養36 h,每2 h在波長600 nm處測定發酵液吸光度值OD600nm,記錄己酸菌生長情況,繪制己酸菌的生長曲線。

1.3.2 己酸菌發酵條件優化

采用單因素優化法,以己酸產量為評價指標,分別對發酵溫度(30℃、33℃、35℃、37℃、40℃)、發酵時間(3 d、7d、11 d、15 d、20 d)、接種量(3%、5%、10%、15%、20%)、裝液量(25mL/100mL、50mL/100mL、75mL/100mL、100mL/100mL、125 mL/100 mL)進行優化,于恒溫培養箱靜置培養,培養基為發酵基礎培養基。

1.3.3 己酸菌發酵培養基優化

在己酸菌發酵條件優化的基礎上,采用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、中心組合設計、響應面法對己酸菌發酵培養基的組成進行優化,確定己酸菌發酵液的最佳生產工藝。

(1)Plackett-Burman試驗設計

采用Minitab17軟件創建Plackett-Burman試驗,選取發酵基礎培養基的9個組分作為篩選對象,篩選出對己酸產量影響顯著的因素,每個因素取2個水平,高水平是低水平的1.5倍。選用變量個數N=20的Plackett-Burman設計表,另加3個空白項(虛擬變量),用于考察試驗誤差。Plackett-Burman試驗因素與水平見表1。

表1 Plaekett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

(2)最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果,選取乙酸鈉、硫酸銨、生物素3個對己酸產量影響顯著的因素,以試驗值的正負效應確定爬坡方向,根據各因素效應值與比例來確定變化步長,梯度增加或者減少試驗值,對產酸影響不顯著的其他因素均取平均水平。

(3)中心組合設計

在Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗結果的基礎上,利用Minitab17軟件創建中心組合設計,進一步對發酵培養基的組成進行優化。以乙酸鈉(X1)、硫酸銨(X2)、生物素(X3)3個因素作為考察因素,己酸產量(Y)為響應值,每個因素取5個水平,共有20個試驗點,其中有15個析因點和5個中心點,中心組合設計因素與水平見表2。

表2 中心復合試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of center composite experiments design

1.3.4 己酸產量的檢測方法

采用高效液相色譜法測定己酸產量。色譜條件：色譜柱：Aminex HPX-87H有機酸色譜柱(300 mm×7.8 mm,9μm),流動相：5 mmol/L的H2SO4溶液,流速：0.6 mL/min,紫外檢測波長：210 nm,柱溫：65℃,進樣量：20μL。

1.3.5 數據處理

每組試驗重復3次,數據均以平均值表示。采用OriginPro 8.5.1繪制圖表,Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、中心復合試驗、響應面試驗的設計與分析均采用Minitab17軟件。

2 結果與分析

2.1 己酸菌種子培養周期的確定

按照1.3.1的方法繪制己酸菌種子的生長曲線,結果見圖1。由圖1可知,己酸菌在6～20 h時為己酸菌的對數生長期,20h時進入減速生長期,30h后進入成熟期。本試驗選取己酸菌種子培養周期為15 h,這個時期的己酸菌種子處于對數中期、活性大、適應性強、延滯期短,更利于己酸菌代謝產酸。

圖1 己酸菌種子的生長曲線Fig.1 Growth curve of caproic acid bacteria seed

2.2 己酸菌發酵條件優化

2.2.1 發酵溫度對己酸菌代謝產酸的影響

考察發酵溫度對己酸產量的影響,結果如圖2所示。由圖2可知,隨著發酵溫度的上升,己酸產量先升高后降低。當發酵溫度為33℃時,最適合己酸菌生長代謝,己酸產量達到最大,繼續升高發酵溫度,影響了己酸菌的生長和代謝產酸,己酸產量開始下降。因此,選擇最佳發酵溫度為33℃。

圖2 發酵溫度對己酸菌代謝產酸的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on acid production of caproic acid bacteria

2.2.2 發酵時間對己酸菌代謝產酸的影響

考察發酵時間對己酸產量的影響,結果如圖3所示。由圖3可知,發酵時間為3 d時,己酸菌發酵液中未檢測到己酸,此時己酸菌正處于生長期；當發酵時間為7～11 d時,己酸產量迅速增加,此時己酸菌處于代謝產酸期,代謝產酸旺盛；當發酵時間為11 d時,己酸產量達到最大值；繼續延長發酵時間,此時己酸菌代謝減緩甚至菌體衰亡,己酸產量沒有繼續增加。因此,選擇發酵時間11 d為宜。

圖3 發酵時間對己酸菌代謝產酸的影響Fig.3 Effect of fermentation time on acid production of caproic acid bacteria

2.2.3 接種量對己酸菌代謝產酸的影響

圖4 接種量對己酸菌代謝產酸的影響Fig.4 Effect of inoculum on acid production of caproic acid bacteria

考察接種量對己酸產量的影響,結果如圖4所示。由圖4可知,隨著接種量的增加,己酸產量呈先升高后下降的趨勢。當接種量＜5%時,己酸產量較少,此時己酸菌生物量積累少,進而影響己酸菌代謝產酸；當接種量＞5%時,己酸菌過多消耗碳源、氮源,反而不利于己酸菌代謝產酸。當接種量為5%時,己酸產量達到最高。因此,選擇接種量5%為宜。

2.2.4 裝液量對己酸菌代謝產酸的影響

圖5 裝液量對己酸菌代謝產酸的影響Fig.5 Effect of loaded volume on acid production of caproic acid bacteria

考察裝液量對己酸產量的影響,結果如圖5所示。由圖5可知,隨著裝液量的增加,己酸產量呈先升高后降低的趨勢。當裝液量＜50 mL/100 mL時,己酸產量較少,由于預留的空間大、氧氣含量高,反而不利于己酸菌代謝產酸；當裝液量為50 mL/100 mL時,己酸產量達到最高；繼續增加裝液量,己酸產量開始降低,這可能是由于己酸菌生長環境預留空間小、氧氣含量低,從而影響到己酸菌代謝產酸。因此,選擇裝液量50 mL/100 mL為宜。

2.3 己酸菌發酵培養基組分優化

2.3.1 Plackett-Burman試驗結果

利用Minitab17軟件對Plackett-Burman試驗結果及各因素效應進行分析,結果如表3、表4所示。由表4可知,從主效應可以看出,因素A(乙酸鈉)、E(硫酸銨)、G(碳酸鈣)、I(對氨基苯甲酸)、K(生物素)對己酸菌代謝產酸影響極顯著(P＜0.01),各因素對己酸菌代謝產酸影響的大小順序為G＞A＞K＞E＞I,其中A、E、G、I為正因素,K為負因素,G的作用主要是中和己酸菌所產的己酸,不是己酸菌生長所需的碳源,加入一定量即可以滿足中和己酸的需求,因此不作為進一步優化的因素。A、E作為己酸菌生長所需的碳源、氮源,K、I作為己酸菌生長所需的生長因子,因此,本研究選取A、E、K作為最陡爬坡試驗中進一步優化的因素。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗各因素效應分析Table 4 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.3.2 最陡爬坡試驗選取中心點

對Plackett-Burman試驗結果進行分析,發現因素A(乙酸鈉)、E(硫酸銨)對己酸菌代謝產酸具有正促進作用,K(生物素)對己酸菌代謝產酸具有負促進作用。在最陡爬坡試驗中,以0.2和0.1為步長增加培養基中A、E的含量,以-0.01為步長減少K的含量。在進一步研究中,其他因素均取平均水平,對影響效果不進行分析。

最陡爬坡試驗設計與結果如表5所示。由表5可知,7號試驗組的己酸產量最大,即乙酸鈉1.8 g/100 mL、硫酸銨1.2 g/100 mL、生物素0.01 g/100 mL,這說明最大響應區間在7號試驗組附近。故以7號試驗組的培養基組分為中心復合試驗的中心點,進一步優化。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3.3 中心組合設計確定最優組合

根據最陡爬坡試驗結果篩選出的試驗中心點,以乙酸鈉(X1)、硫酸銨(X2)、生物素(X3)進行3因素5水平的中心復合試驗,其他因素均取平均水平,共進行20次試驗,中心組合設計及結果如表6所示。

表6 中心組合試驗的設計及結果Table 6 Design and results of center composite experiments

2.3.4 模型的建立與方差分析

利用Minitab17軟件對中心組合試驗的數據進行多元回歸擬合分析,以乙酸鈉(X1)、硫酸銨(X2)、生物素(X3)為影響因素,己酸產量(Y)為響應值,經回歸擬合后,己酸產量與乙酸鈉、硫酸銨、生物素含量的回歸方程表示為：

Y=17.847+0.154X1+0.315X2-0.885X3+0.064X1X2-1.301X1X3+

0.185 X2X3-0.127X12-1.177X22-0.276X32

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

對模型進行方差分析,結果見表7。由表7可知,回歸模型極顯著(P＜0.01),決定系數R2為0.923,說明回歸模型的擬合度很好,表明己酸產量的試驗值和預測值有很好的一致性；校正決定系數R2adj為0.854,說明己酸產量的回歸模型能夠在85.4%的程度上解釋試驗結果,僅有14.6%不能用這個回歸模型表示。其中因素X3、X22、X1X3對己酸菌代謝產酸影響極顯著(P＜0.01),其他一次項、二次項、交互項對己酸菌代謝產酸影響均不顯著(P＞0.05),失擬項P值為0.563,影響不顯著(P＞0.05),進一步說明此模型的擬合度很好。變異系數(variable coefficient,CV)表示試驗的精確度,數值越大,表明試驗的可靠性越差,本試驗中響應值(Y)的CV值為12.238%(＜15%),說明回歸模型方程能夠較好地反應真實值。綜上所述,該回歸模型擬合程度好,試驗誤差小,能夠準確的分析和預測己酸的產量。

2.3.5 響應面結果分析及驗證試驗

利用Minnitab17軟件,繪制3因素對己酸菌代謝產酸影響的響應面及等值線,結果見圖6。由圖6可知,乙酸鈉與生物素之間的交互作用對己酸菌代謝產酸影響顯著,當硫酸銨添加量為定值,乙酸鈉含量在中心點附近時,隨著生物素含量梯度減少,己酸產量逐步提高；生物素與硫酸銨之間的交互作用對己酸菌代謝產酸影響不顯著,當乙酸鈉添加量為定值,硫酸銨在中心點附近時,隨著生物素含量梯度減少,己酸產量逐步增加；乙酸鈉與硫酸銨之間的交互作用對己酸菌代謝產酸影響也不顯著,當生物素添加量為定值,乙酸鈉、硫酸銨含量都在中心點附近時,己酸產量最高。

圖6 乙酸鈉、硫酸銨和生物素的交互作用對己酸菌代謝產酸影響的響應曲面和等值線Fig.6 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between sodium acetate,ammonium sulfate and biotin on acid production of caproic acid bacteria

對多元回歸擬合方程進行分析,得出己酸菌發酵培養基的組成為乙酸鈉1.644 g/100 mL、硫酸銨1.213 g/100 mL、生物素0.013 g/100 mL,其余組分均取平均值,再結合單因素優化的發酵條件,最終確定己酸菌發酵液的最佳培養工藝。在此培養工藝條件下,進行3次重復驗證試驗,所得己酸平均產量為18.93 g/L,試驗值與回歸擬合方程預測值(17.69 g/L)相差7%,再次證實了該模型的有效性。

3 結論

本試驗以白酒生產用的己酸菌為研究對象,在單因素的基礎上,對其發酵條件進行了優化,在此基礎上利用PB試驗、最陡爬坡試驗、中心組合設計試驗、響應面法對其發酵培養基的組成進行了優化,最終確定了最佳的己酸菌發酵液的發酵條件為發酵溫度33℃、接種量5%、裝液量50 mL/100 mL、發酵時間11 d；發酵培養基的組成為乙酸鈉1.644 g/100 mL、硫酸銨1.213 g/100 mL、生物素0.013 g/100 mL、碳酸鈣1.0 g/100 mL、磷酸氫二鉀0.025 g/100 mL、硫酸鎂0.025g/100mL、酵母浸粉0.625g/100mL、乙醇2.5mL/100 mL、對氨基苯甲酸0.062 5 g/100 mL。在此生產工藝條件下,獲得的己酸菌發酵液中己酸產量達18.93 g/L,比初始發酵工藝提高了169%,為己酸工業化生產提供了理論依據,同時也為實現白酒機械化生產奠定了基礎。

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