他莫昔芬通過阻斷雌激素效應而抑制MCF-7細胞對單核細胞的招募活化

郭永紅，丁景弦

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據其激素受體狀態可分為激素依賴型乳腺癌和激素非依賴型乳腺癌。兩種類型乳腺癌患者生存復發模式迥異，前者總體復發率較后者低，復發時限呈現雙峰分布，即在術后3年及術后7年各有一復發高峰，而激素非依賴型乳腺癌復發高峰主要是在術后2年[1]。近年來，越來越多的研究聚焦于腫瘤細胞賴以生存的微環境上。腫瘤微環境即非腫瘤細胞成分，包括細胞外基質和各種基質細胞，它們為癌細胞發生發展提供滋養。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是乳腺癌微環境中的主要組成部分，在腫瘤發展中扮演了十分重要的角色，有望成為乳腺癌治療的新靶點[2-3]。TAMs由血液循環中的單核細胞游出進入組織后在單核-巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、白介素6（IL-6）及白介素10（IL-10）等的作用下分化而成，通常具有替代活化的M2表型，參與組織修復、基質重塑和血管生成從而促進腫瘤的發展，越來越多的研究表明TAMs的豐度與乳腺癌患者的不良預后呈明顯正相關[4-5]。乳腺癌細胞通過分泌單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）及M-CSF招募單核細胞并誘導其分化為M2型TAMs，進而導致了血管內皮生長因子的合成，從而促進腫瘤生長。Levano等發現與激素依賴型型乳腺癌相比，激素非依賴型乳腺癌中往往高表達MCP-1及M-CSF，而MCP-1及M-CSF水平與乳腺癌的高侵襲和高轉移具有明顯的相關性[6-7]。我們發現激素依賴型乳腺癌細胞株MCF-7在體外常規培養時具有高增殖能力，然而不添加雌激素卻不能有效形成移植瘤。為此，本研究嘗試探討雌激素對激素依賴型乳腺癌單核細胞活化相關細胞因子表達的影響，并通過他莫昔芬競爭性阻斷雌激素下游效應，為內分泌治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 激素依賴型人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC細胞庫，單核細胞株U937由復旦大學上海醫學院生物化學與分子生物學系馬端教授饋贈。利用GFP-PURO雙標即用型慢病毒顆粒和RFP-NEO雙標即用型慢病毒顆粒（均購自美國Gent arget公司）分別構建紅色熒光蛋白MCF-7和綠色熒光蛋白U937穩定表達株用于本研究。細胞培養于含有10%FBS的RPMI1640（美國GIBCO公司）培養基中，隔天換液，待細胞長到90%時按照1∶3的比例傳代，取對數生長期的細胞用作實驗。將5×103個人乳腺癌細胞株MCF-7接種于96孔板中，待細胞貼壁后吸出培養上清，每組3個復孔，分別加入100μl無血清培養基、10 nM雌二醇、10 nM雌二醇+1μM他莫昔芬及1μM他莫昔芬無血清培養基繼續培養48 h后收集上清，200 g離心5 min除去細胞碎片。上清放置于-80℃冰箱保存待檢測。

1.2 細胞因子芯片檢測 細胞因子檢測試劑盒由Bio-Pl ex公司專門制備。細胞因子芯片利用磁珠吸附原理檢測不同培養上清中單核細胞分化相關細胞因子MCP-1及M-CSF濃度，實驗操作嚴格按照說明書操作流程。

1.3 不同處理組MCF-7細胞與U937細胞共培養 將5×105個MCF-7細胞接種于Tr answel l板（6孔，孔徑0.4μm）上室中，下室種5×105個U937細胞，共培養48 h后觀察不同處理組乳腺癌細胞對U937細胞定向分化M2型TAMs的能力。

1.4 RT-qPCR驗證M2型TAMs特異性標記CD163 收集經與不同處理組MCF-7細胞共培養48 h的U937細胞，利用Trizol按實驗流程提取總RNA,反轉錄得到cDNA。內參基因GAPDH擴增片段長度200 bp，上游引物：5’-acccagaagactgtggatgg-3’，下游引物：5’-t ct agacggcaggt caggt c-3’；M2型TAMs特異性標記基因CD163擴增片段長度146bp，上游引物：5’-cgagt taacgccagt aagg-3’，下游引物：5’-gaacat gtcacgccagc-3’。PCR反應條件參考既往發表文獻。

1.5 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件作統計分析。計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理組MCF-7細胞培養上清中MCP-1及M-CSF的表達差異 Bio-Rad公司定做的細胞因子芯片利用磁珠吸附原理檢測不同處理組乳腺癌細胞株MCF-7培養上清中單核細胞分化相關細胞因子MCP-1及M-CSF濃度。測得對照組MCF-7細胞培養上清及經雌二醇、雌二醇+他莫昔芬、他莫昔芬分別處理組細胞培養上清中MCP-1及M-CSF濃度分別為（31.33±2.4）、（75.37±5.5）、（41.97±5.8）、（24.5±5.33）pg/ml及（1.83±0.18）、（29.71±8.06）、（10.9±2.38）、（1.54±0.08）pg/ml，不同處理組MCP-1及M-CSF濃度差異具有統計學意義（P＜0.05）。雌二醇可增強MCF-7細胞分泌MCP-1及MCSF的能力，而他莫昔芬可部分阻斷該效應，見表1。

表1 細胞因子芯片檢測雌二醇及他莫昔芬對MCF-7細胞培養上清中M-CSF及MCP-1的影響Table1 Theeffect of estradiol and tamoxifen on M-CSF and MCP-1 in theculturesupernatant of MCF-7 cellsby cytokinemicroarray

2.2 不同處理組MCF-7細胞對共培養體系中U937細胞的誘導分化差異 不同處理組MCF-7細胞與U937細胞共培養48 h后U937細胞形態發生改變，由光滑小圓形懸浮細胞部分轉變成為不規則形細胞，并有部分細胞呈現貼壁生長特性（見圖1）。經RT-qPCR檢測M2型巨噬細胞相關標記CD163在不同處理組中表達存在差異（見圖2）。

3 討論

圖1 單核細胞株U937及其與乳腺癌細胞株共培養后細胞形態變化Figure1 Mononuclear cell line U937 and cell morphological changes after co culture with breast cancer cell lines

圖2 單核細胞株U937與不同處理組乳腺癌細胞株共培養48 h后CD163的表達差異Figure2 Expression difference of CD163 after 48 h co culture of U937 mononuclear cell line and different treatment group breast cancer cell lines

雌激素在激素依賴型乳腺癌的發生和發展中起著重要作用。研究發現，雌激素主要通過與雌激素受體結合來發揮促腫瘤效應。他莫昔芬是一種常見的激素依賴型乳腺癌患者內分泌治療藥物，它通過與雌二醇競爭性結合雌激素受體，從而阻斷雌激素對激素依賴型乳腺癌細胞的促進作用，可有效降低激素依賴型乳腺癌患者的復發死亡風險，因而被臨床廣泛用于雌激素受體陽性的乳腺癌患者[8-10]。腫瘤的進展取決于腫瘤細胞內在的生物學特性及其所處的腫瘤微環境兩方面。TAMs腫瘤微環境中的重要組份，它通過促進腫瘤的生長、轉移、新血管生成和瘤旁炎性反應等發揮促癌作用[11-12]。研究表明TAMs在乳腺癌組織中的豐度是乳腺癌預后的獨立預測因素之一[5，13]。

本研究利用細胞因子芯片檢測雌激素及他莫昔芬對激素依賴型乳腺癌細胞株培養上清中單核細胞趨化分化相關因子的表達差異，并通過共培養體系檢測MCF-7細胞對單核細胞株U937的分化誘導，最后利用RT-PCR技術對誘導分化的細胞進行表型鑒定證實了雌二醇能促進激素依賴型乳腺癌細胞株MCF-7分泌MCP-1及M-CSF，從而增強其對單核細胞活化的能力，他莫昔芬可通過競爭性結合雌激素受體而發揮阻斷效應。這為激素受體陽性乳腺癌通過內分泌治療降低其復發風險提供了新的理論依據。

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