HIV-1感染者CD73+CD8+ T細胞減少與T細胞異常活化的相關性研究

常文仙，張和倩，周雙男，黃輝煌，涂 波，周春保，張紀元，王福生

AIDS是由HIV-1感染引起的免疫缺陷性疾病，其免疫學特征有CD4+T細胞進行性減少，持續性免疫激活和系統性炎癥[1-2]。隨著高效抗反轉錄病毒治療（highly active anti-retroviral therapy,HAART）的應用，HIV-1/AIDS患者免疫功能逐漸恢復，生活質量得以改善，AIDS相關性死亡明顯減少[3]。但HIV-1感染者還是具有較高的發病率和病死率，每年仍有很多患者死于心血管病或腫瘤等非AIDS相關事件[4-5]。研究證實，HIV-1感染中，持續的免疫激活不僅與疾病進展密切相關，而且與患者早期免疫衰老和發病率增加有關[6-7]。因此，人們猜測HIV-1感染者發生非AIDS相關事件和死亡的風險增加也是由于持續的免疫激活所致[8]。

CD73是一種胞外核苷酸酶，表達于多種免疫細胞表面，其與另一種核苷酸酶CD39協同作用將ATP轉化為腺苷，腺苷與相應受體結合發揮免疫學效應，在多種疾病的發生、發展中扮演重要角色[9-10]。炎癥或應激條件下，ATP從受損細胞內釋放，與其受體結合激活免疫細胞從而促進炎性反應。CD39和CD73將ATP逐步水解生成腺苷，一方面降低了ATP引起的炎性反應，另一方面生成的腺苷本身就是免疫抑制性物質[11]。腺苷不僅能抑制淋巴細胞的活化和增殖，還可以調節抗原提呈細胞的作用，抑制其細胞因子的釋放，從多方面降低免疫反應，避免過度的免疫活化[12-13]。因此，CD39/CD73/腺苷途徑作為“免疫開關”，將ATP驅動的促炎反應轉變為由腺苷介導的抗炎狀態[14]，其在HIV-1感染相關的免疫活化中發揮的作用逐漸受到重視。

研究報道，HIV-1感染者調節性T細胞（regulatory T cells,Tregs）上CD39表達上調，并協同Tregs抑制免疫反應，有助于控制免疫活化[15-16]。同時Moreno-Fernandez等[17]研究發現，HIV-1感染早期，CD39+Tregs可通過CD39依賴機制抑制T細胞內HIV-1的復制，對機體起到保護作用。此外，Nikolova等[16]報道CD39的變異體在非洲人群和亞洲人群中表達水平不同，而且具有延緩AIDS進展的作用。CD73是CD39/CD73/腺苷途徑的限速酶，研究發現HIV-1感染者外周血中CD4+和CD8+T細胞上CD73的表達均明顯減少，且與AIDS進展相關[18-20]。但對于不同地區的HIV-1感染群體，其T細胞上CD73的變化特點及其與疾病進展的關系還不清楚。CD38是活化性分子，檢測CD38+CD8+T細胞的頻率可以反映HIV-1感染者T細胞的活化程度。因此，本研究針對我國HIV-1感染者外周血CD8+T細胞上CD73的表達情況展開研究，并分析其與AIDS疾病進展和T細胞活化的關系，進而探討CD73/腺苷通路在中國AIDS人群疾病進展中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究入選HIV-1感染者65例，所有病例均來自解放軍第三〇二醫院2016年4月—2017年2月期間的門診患者，平均年齡為（34.2±9.6）歲，所有患者為未接受抗病毒治療，診斷符合中華醫學會感染病學分會艾滋病學組2015年修訂的《艾滋病診療指南》[21]。排除標準：①年齡＜18歲和＞65歲者；②目前存在機會性感染者；③妊娠婦女或產褥期婦女；④有精神疾病或其他嚴重疾病者；⑤不愿意合作者。如表1所示，HIV-1感染者根據CD4+T細胞計數分為CD4+T細胞計數≥ 200個/μl組和＜ 200個/μl組。另外在病例收集期間納入27例實驗室同事作為健康對照（health control,HC），平均年齡為（32.7±6.8）歲。所有病例及健康對照均簽署知情同意書。

1.2 試劑 本實驗所用的主要熒光抗體包括鼠抗人CD8-PerCP、鼠抗人CD38-APC、鼠抗人CD3-FITC/CD45-PerCP/CD8-PE/CD4-APC抗體組合均購自美國BD Biosciences公司；鼠抗人CD3-BV510、鼠抗人CD73-BV421購自美國Biolegend公司，同時購買對應的同型對照抗體。

1.3 方法

1.3.1 CD4+T細胞計數 取HIV-1感染者新鮮采集的EDTA抗凝血50 μl至Trucount管內，加入CD3/CD45/CD8/CD4抗體組合共20 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入免洗溶血素450 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min后利用FACS Calibur型流式細胞儀檢測，實驗數據用MultiSET軟件進行分析[22]，得到CD3+、CD4+及CD8+T細胞計數。1.3.2 流式細胞儀檢測CD8+T細胞上CD73和CD38的表達 取新鮮采集的EDTA抗凝血300 μl至5 ml流式管內，依次加入熒光標記抗體CD3-BV510 5 μl、CD8-PerCP 5 μl、CD73-BV421 5 μl、CD38-APC 20 μl；另設同型對照管，依次加入熒光抗體CD3-BV510、CD8-PerCP、IgG-APC各20 μl及 IgG-BV421 5 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入3 ml溶血素，震蕩后避光10 min，1600 rpm離心5 min，棄去上清，再用2 ml PBS洗滌2遍，離心后棄上清，加300 μl 1%多聚甲醛固定，放入4 ℃冰箱，24 h內使用FACS Verse型流式細胞儀檢測[31]，實驗數據用Flowjo 7.6軟件進行分析。

1.3.3 血漿HIV-1 RNA檢測 取EDTA抗凝血6 ml，2000 rpm離心10 min，吸取血漿，放入-80 ℃冰箱凍存。待標本收集完全后，取400 μl血漿，利用HIV-1核酸定量檢測試劑盒（QIAGEN）， 在 CFX96TM Real-Time system型熒光定量PCR分析儀（BIO-RAD）上定量檢測血漿中HIV-1 RNA。擴增的靶核酸位置是HIV gag區，可擴增HIV-1 M群的A-H亞型和N群基因型樣本。實驗設1個內部定量標準品，陰性質控，結果以每毫升血漿含病毒拷貝數表示[24]。

1.4 統計學處理 用SPSS 19.0軟件進行統計學分析并用GraphPad Prism 5.0制圖。正態分布的定量資料以±s表示，非正態分布的定量資料以中位數（最小值，最大值）表示。2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；相關性分析采用Spearman相關檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的頻率變化 統計顯示，HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的頻率明顯低于HC組（U= 139.000，P= 0.001），見圖1A。HIV-1感染者的組間比較顯示，CD4+T細胞計數＜ 200個/μl組的外周血CD73+CD8+T細胞的頻率顯著低 于CD4+T細胞計數≥ 200個/μl組（U=206.500，P= 0.017），見圖1B。

2.2 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞絕對計數的變化 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞絕對計數明顯低于HC組（U=301.000，P=0.001），見圖1C。CD4+T細胞計數＜ 200個 /μl組外周血CD73+CD8+T細胞絕對計數顯著低于CD4+T 細胞計數≥ 200個 /μl組（U= 180.000，P=0.005），見圖1D。

圖1 HIV-1感染者CD73+CD8+ T細胞頻率和絕對計數的變化Figure 1 Change of the frequency and absolute count of CD73+CD8+ T cells in HIV-1 infected patients

2.3 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞絕對計數、頻率與CD4+T細胞計數的相關性 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的絕對計數、頻率均與其CD4+T細胞計數呈正相關（r=0.555，P=0.001；r=0.342，P=0.005），見圖2 A和B。

2.4 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞絕對計數與HIV-1載量的相關性 HIV-1感染者CD73+CD8+T細胞絕對計數與血漿HIV-1載量呈現弱負相關（r=-0.261，P=0.035），見圖2C，但其頻率與HIV-1載量之間沒有相關性（r=-0.140，P=0.265），見圖2D。

2.5 HIV-1感染者CD73+CD8+T細胞絕對計數、頻率與CD38+CD8+T細胞頻率的相關性 HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的絕對計數和頻率均與其CD38+CD8+T細胞頻率呈負相關（r=-0.384，P=0.002；r=-0.387，P=0.001），圖3A和B。

3 討 論

持續的免疫活化和系統性炎癥是HIV-1慢性感染期的重要特征，可加快HIV-1/AIDS患者免疫衰老和系統老化的過程，對患者的預后和生存帶來諸多不利影響[25]。HIV-1感染中免疫過度活化的主要原因是循環中HIV-1的持續存在，病毒直接或間接作用于機體免疫系統，引起廣泛性免疫活化[6]。但在部分HAART后血漿病毒載量低于檢測下限的患者中仍能觀察到持續的免疫激活反應，表明除了病毒本身的作用外，還有其他引起免疫激活的因素存在，如腸道菌群的移位，其他病毒如巨細胞病毒的再活化以及體內T細胞的平衡失調等[19]。

圖2 HIV-1感染者CD73+CD8+ T細胞絕對計數、頻率與CD4+ T細胞計數和HIV-1載量的相關性Figure 2 Correlation of absolute count and frequency of CD73+CD8+ T cells with CD4+ T cell count and HIV-1 viral load in HIV-1 infected patients

CD38是衡量T細胞活化水平的主要表面分子，有研究表明CD38+CD8+T細胞在HIV-1感染者體內顯著增多，既反映了HIV-1/AIDS患者的免疫活化水平，也是疾病進展的獨立預測因素[26]。本研究就HIV-1感染后CD73+CD8+T細胞與AIDS進展的關系及其在T細胞免疫應答和免疫活化方面的作用展開研究。本研究首先檢測了CD73在HC及HIV-1感染者CD8+T細胞上的表達情況。結果顯示，與HC組相比，HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的頻率和絕對計數均明顯減少，且CD4+T細胞計數＜ 200個/μl的AIDS患者減少更為明顯，相關性分析顯示CD73+CD8+T細胞絕對計數與CD4+T細胞計數呈明顯正相關。本研究結果與國外的報道一致[18-20]，后又進一步證實HIV-1感染者體內CD73+CD8+T細胞減少并與AIDS疾病進展密切相關。CD38是T細胞活化的分子標志，本研究中HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的頻率及絕對計數均與其CD38+CD8+T細胞頻率呈負相關，提示該群細胞在控制T細胞活化方面具有一定作用。

此外，關于CD73+CD8+T細胞對抗病毒免疫應答的影響，相關性分析發現，只有CD73+CD8+T細胞絕對計數與HIV-1感染者血漿中病毒載量呈弱負相關，且相關系數（r=0.261）較小，這可能與實驗樣本量不足或個體差異有關，但總體可見HIV-1感染者中CD73+CD8+T細胞的減少不利于病毒的清除。國外研究認為CD73+T細胞可通過生成腺苷抑制T細胞免疫反應[19]，因此CD73+CD8+T細胞的減少應該有助于抗病毒免疫反應，但本研究的結果與之相反，提示CD73+CD8+T細胞在抗病毒免疫方面可能存在其他未知的機制，需要更深入的研究加以證實。

總之，本研究發現HIV-1感染者外周血CD73+CD8+T細胞的絕對計數和頻率均明顯減少，并與T細胞活化和AIDS進展密切相關。而關于CD73+CD8+T細胞減少的原因以及其影響病毒載量和T細胞活化的相關機制目前還不清楚，未來可以針對這幾方面展開研究，從而闡明該群細胞在AIDS疾病進展中的作用機制。

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