HBsAg/HBsAb雙陽性慢性乙型肝炎患者HBV S基因免疫逃逸相關變異分析

唐子淋，劉 妍，劉佳梁，思蘭蘭，李 樂，廖 昊，邵金曼，徐東平，李 進

HBV感染是一種全球傳染性疾病，WHO 2017年最新發布的數據顯示在全球范圍內約2.57億人有慢性HBV感染[1]。HBsAg是用于診斷HBV感染的重要標志，而HBsAb是由HBsAg暴露的抗原決定簇刺激機體產生的特異性保護抗體，可以中和血清中的HBsAg。通常情況下HBsAb出現在HBsAg消失后或注射乙型肝炎（乙肝）疫苗后，是HBV感染終止和機體對HBV產生免疫力的標志，但在臨床實際檢測中，也可見血清HBsAg和HBsAb同時陽性的現象[2]。目前這種雙陽性現象的臨床意義和發生機制尚未完全明確，可能與多種因素有關，其中HBV S基因變異引起的抗原性改變，可能與HBV感染慢性乙肝患者血清中HBsAg/HBsAb雙陽性現象相關[3-4]。

HBV包膜蛋白由preS/S基因編碼，其中S基因主要親水區（major hydrophilic region,MHR）（aa 99～169）編碼暴露在病毒顆粒表面上的主要構象表位，該區段發生的變異，包括替換、插入、缺失和提前終止都能影響 HBsAg 的表達、分泌和識別[5-6]。有研究表明如若變異使病毒基因在原有的s146-148NCT N-糖基化位點基礎上額外增加NXT/S（X不為P）位點，則會引入新增N-糖基化變異，可降低HBsAb與HBsAg的親和力，增加病毒分泌，從而引起免疫逃逸，可造成HBsAg/HBsAb雙陽性[7]。本研究旨在明確HBsAg/HBsAb雙陽性慢性乙肝患者HBV S基因MHR免疫逃逸相關變異特點，分析變異與雙陽性的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 2007—2013年于解放軍第三〇二醫院就診且HBsAg與HBsAb同時呈陽性的慢性乙肝患者。HBsAg/HBsAb雙陽性組（雙陽性組）納入標準：①間隔至少半年，連續2次以上檢測確認HBsAg與HBsAb同時呈陽性；②無HCV、HDV、HIV重疊感染；③腹部超聲、CT、MRI等影像學檢查或肝組織病理學檢查未提示肝硬化及原發性肝癌。最終共89例患者被納入雙陽性組。同時根據以上第②及第③條標準隨機匹配納入148例HBsAg陽性且HBsAb陰性的慢性乙肝患者作為HBsAg單陽性組（單陽性組）。慢性乙肝診斷均依據我國《慢性乙型肝炎防治指南（2010年）》[8]確立。本研究納入的237例患者均簽署相關知情同意書，并經解放軍第三〇二醫院倫理委員會審查批準。

1.2 試劑 病毒DNA提取試劑盒購自于北京天恩澤生物技術有限公司；電泳marker（2000 bp）購自于 TaKaRa大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖以及2×EasyTaq PCR SuperMix均購自于北京全式金生物技術有限公司；PCR產物回收純化試劑盒購自于美國Qiagen公司；引物合成和基因測序工作由北京天一輝遠生物技術有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 乙肝血清學標志物及血清HBV DNA定量 乙肝血清學標志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）及血清HBV DNA定量由解放軍第三〇二醫院臨床檢驗中心檢測。乙肝血清學標志物采用化學發光法定性檢測，HBV DNA定量采用羅氏公司商品試劑盒進行檢測，其檢測下限為100 IU/ml。

1.3.2 巢式PCR擴增HBV S基因并測序 從解放軍第三〇二醫院血清樣本庫中提取2組患者血清樣本。采用病毒提取試劑盒提取2組患者血清HBV DNA，使用本課題組自主研發的一管式巢式PCR法擴增HBV S基因技術（國家發明專利ZL 200910092331.1，病毒載量的擴增下限為20 IU/ml），PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并行基因測序。

1.3.3 HBV基因型與HBV S基因免疫逃逸相關變異與新增N-糖基化變異分析 使用DNASTAR軟件中的SeqMan 7.1.0模塊進行序列拼接。使用MEGA 4軟件對測序所得HBV DNA序列進行基因型分型，使用DNASTAR Lasergene MegAlign軟件進行變異比對分析。應用GenBank中標準參考序列進行比較，標準參考序列從在線肝炎病毒數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）獲得。本研究重點分析既往研究中報道過的HBV S基因MHR免疫逃逸相關變異（表1）[9-13]。

表1 既往研究報道的HBV S基因MHR免疫逃逸相關變異Table 1 Immune escape related mutations within MHR of HBV S gene in previous reports

1.4 統計學處理 使用Excel 2007軟件進行數據整理，使用IBM SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析。本研究采用的巢式PCR方法擴增HBV S基因的專利技術檢測下限約為20 IU/ml，而HBV DNA臨床檢驗科檢測下限為100 IU/ml，故低于臨床檢測下限的樣本HBV DNA按照中間值60 IU/ml計算，即1.78 log10IU/ml。變異率比較采用四格表χ2檢驗，2組間非正態分布的連續性數據比較采用非參數檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組慢性乙肝患者基本臨床資料 本研究最終納入的患者均為C基因型HBV感染。2組患者一般臨床情況如下：雙陽性組患者年齡最小為1歲，最大為61歲，中位數為39.0歲，其中男性65例（73.03%），女性24例（26.97%）。單陽性組患者年齡最小為2歲，最大為89歲，中位數為40.5歲，其中男性128例（86.49%），女性20例（13.51%）。2組患者在ALT、TBIL、HBV DNA載量、HBeAg陽性率方面差異均無統計學意義（表2）。

表2 2組患者一般臨床資料Table 2 General clinical data of patients in 2 groups

2.2 2組患者HBV S基因MHR免疫逃逸相關位點變異分析 雙陽性組HBV S基因MHR免疫逃逸相關變異檢出率（31.46%，28/89）顯著高于單陽性組（18.92%，28/148）（χ2=4.845，P=0.028）。單陽性組在46個免疫逃逸相關位點中有15個位點發生了變異；而雙陽性組中46個免疫逃逸相關位點有18個位點發生了變異，其中sL110I/S（12.36%，11/89）、sT113N/S（12.36%，11/89）、sT131I/N/P（8.99%，8/89）和sS143L/M/T（10.11%，9/89）4個單位點變異檢出率明顯高于單陽性組（圖1）。

圖1 2組患者HBV S基因MHR免疫逃逸突變情況注：兩組比較，sL110I/S變異χ2=8.742，P=0.003； sT113N/S變異 χ2=10.954，P=0.001；sT131I/N/P變 異 χ2=4.615，P=0.032；sS143L/M/T變異χ2=5.970，P=0.015；*.P＜0.05Figure 1 Mutation of immune escape at HBV S gene MHR of patients in 2 groups

多位點聯合變異檢出率在雙陽性組（20.22%，18/89）顯著高于單陽性組（6.08%，9/148）（χ2=11.014，P=0.001），多位點聯合變異形式見表3。雙陽性組以3聯變異形式為主，且存在3例4聯多位點聯合變異，2例6聯多位點聯合變異，其中sL110I+sT113S+sS143T變異形式最多，共7例（38.89%，7/18），而在單陽性組中未發現這種多位點變異形式。單陽性組則以2聯為主，僅有2例出現3聯多位點聯合變異。

2.3 2組患者新增N-糖基化變異分析 雙陽性組患者中有7例在HBV S基因的MHR內檢出新增N-糖基化變異（7.87%，7/89），其中5例患 者 檢 出 sT131N+M133T→s131-133NST，1例患者檢出sT116N→s116-118NST，1例患者檢出sT131N+M133T→s131-133NST合并sT116N→s116-118NST，其中sT131N+M133T→s131-133NST檢出率最高（71.43%，5/7）。而單陽性患者僅3例檢出HBV S基因MHR新增N-糖基化變異（2.03%，3/148），2例 sT131N+M133T→s131-133NST，1例sQ129N→s129-131NGT。2組患者新增N-糖基化變異檢出率差異具有統計學意義（χ2=4.687，P=0.030）（表 4）。

3 討 論

HBV感染可以引起急、慢性病毒性肝炎，肝纖維化，更與肝細胞癌的發生和發展密切相關。乙肝血清五項是臨床中常用的診斷HBV感染的指標。其中HBsAg與HBsAb的血清學轉換更是判斷患者病毒是否完全清除，是否能夠停止服用抗HBV藥物的重要參考依據。通常HBsAg與HBsAb不會同時處于陽性狀態，但自1976年以來，血清HBsAg和HBsAb同時陽性的現象屢有報道[5，14]。目前認為關于HBsAg與HBsAb共存機制主要與HBV S基因免疫逃逸變異相關。HBV S基因編碼HBsAg，其MHR內（尤其是α決定簇）的氨基酸變異可使HBsAg的抗原性發生改變，使HBsAg無法與HBsAb中和，可造成HBsAg/HBsAb雙陽性[5，14-15]，此外HBV S基因MHR新增N-糖基化位點變異亦可降低HBsAg對HBsAb的親和力，從而造成HBsAg/HBsAb雙陽性現象[7]。

表3 2組患者多位點聯合變異分析Table 3 Analysis of multiple mutation of immune escape at MHR of patients in 2 groups

表4 2組患者MHR新增N-糖基化位點變異分析Table 4 Analysis of additional N-glycosylation mutations at MHR of patients in 2 groups

本研究共納入89例雙陽性與148例單陽性慢性乙肝患者。為了消除HBV基因型不同而對實驗結果產生的影響，本研究將實驗對象限定為HBV C基因型感染。2組患者的年齡、ALT、TBIL、HBV DNA載量、HBeAg陽性率臨床指標均未見顯著差異。在經過對2組患者HBV S基因測序結果分析發現雙陽性組患者免疫逃逸相關位點累計變異率明顯高于單陽性組，其中sL110I/S、sT113N/S、sT131I/N/P和sS143L/M/T的變異檢出率均顯著高于單陽性組。雙陽性組患者多位點聯合變異率亦顯著高于單陽性組，且變異形式更復雜，以3聯多位點變異形式sL110I+sT113S+sS143T為主（38.89%，7/18），而這種多位點變異形式未發生在單陽性組中。單陽性組以2聯多位點變異形式為主。

此外，HBV S基因的MHR（aa 99～169）發生替換、插入、缺失等變異可能會引入新增N-糖基化變異，引起抗原性改變。在本研究中，雙陽性組新增N-糖基化變異率亦顯著高于單陽性組，雙陽性組sT131N+M133T→s131-133NST檢出率最高，為71.43%。此外，有研究表明與野生型 HBsAg 相比，新增 N-糖基化變異的HBsAg/HBsAb 結合力減弱，在表型分析中發現比野生型HBsAg具有更好的病毒包膜形成和分泌能力，因此推測HBV S 基因新增 N-糖基化變異可能在HBsAg/HBsAb 雙陽性共存狀態中發揮重要作用[16]。

本研究發現2組患者男女比例有差異（P=0.010），因此進一步分析了2組發生變異男女患者比例，雙陽性組28例發生變異的患者中有20例男性（71.43%）；單陽性組28例發生變異的患者中有24例男性（85.71%）；2組發生變異的患者男女比例差異無統計學意義（P=0.193）。推測2組總體樣本的性別差異可能與患者的選擇和抽樣誤差有關。本研究為臨床真實世界的橫斷面研究，缺乏動態的樣本信息，但樣本量較為充足，有一定的臨床意義。

總之，與HBsAg單陽性患者相比，HBsAg/HBsAb雙陽性患者中HBV S基因可檢出更多變異種類、更高變異檢出率、更多聯合變異復雜形式的MHR免疫逃逸相關變異，并且新增N-糖基化變異檢出率也更高，這些變異可能是引起HBsAg/HBsAb雙陽性共存的驅動因素之一。本課題組之前的研究發現HBV S基因MHR區新增N-糖基化變異是HBsAg/HBsAb雙陽性患者進展為肝癌的主要風險因素[17]，因此應關注并定期監測雙陽性慢性乙肝患者的HBV S基因變異與病情進展。

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