富硒黃芪提取物對免疫抑制大鼠細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及 TN F-α 的影響 *

李 欽 ，范 強 ，胡繼宏 ，高 博 ，宋 爽 ，李海東 ，楊麗霞

1甘肅衛生職業學院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫藥大學；3甘肅省渭源縣康榮中藥材科技有限公司；4甘肅省中醫藥研究院

黃芪始載于《神農本草經》，為豆科黃芪屬植物膜莢黃芪及內蒙古黃芪的根[1]。黃芪屬植物是一種多年生、深根性的草本藥用植物，別名綿芪、綿黃芪。在我國主要分布于北方地區，普遍生長在東北的東部山區及大興安嶺，部分平原地區亦可見到，此外河北、山西、山東、內蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆等省區均有分布。黃芪性溫味甘，歸肺、脾經，具有補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。黃芪的主要化學成分有多糖類、皂苷類和黃酮類等[2]，具有增強免疫功能、抗應激、抗衰老、保肝、利尿、降壓以及較廣泛的抗菌作用[3-8]。但是藥用黃芪由于產地、采收季節和生長年限的不同而存在差異，這些差異使得不同來源的同種黃芪的化學組成含量也可能不同，必然影響臨床療效和中藥的實驗研究。富硒黃芪為甘肅省道地藥材，本研究主要觀察富硒黃芪提取物對免疫抑制大鼠模型免疫細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 110只SPF級SD大鼠，體質量(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫藥大學科研試驗中心提供。實驗動物質量合格證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 實驗藥品與試劑 富硒黃芪、普通黃芪購自甘肅省渭源縣康榮中藥材專業合作社。提取物的制備：將2種黃芪藥材粉碎過10目篩，加水浸泡30分鐘，經超聲提取2次，45 min/次，合并濾液，濃縮，濾過，加適量蒸餾水，將溶液pH調至近中性，G4垂熔玻璃漏斗濾過，使其成為1g/mL水溶液，滅菌，冷藏備用。使用前用蒸餾水稀釋成1mL/0.1kg(體質量)。注射用環磷酰胺[安道生，Baxter Oncology(德國)提供]。酶聯免疫試劑盒：白細胞介素 2(IL-2)、白細胞介素 4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實驗儀器 LX-820型醫用低速離心機(金壇市恒豐儀器廠)；FA2004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫抑制大鼠模型的建立 110只大鼠，腹腔注射環磷酰胺，每次80 mg/kg(體質量)，1次/d，連用3天，構建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠為空白對照組，腹腔注射等體積蒸餾水。第3次注射24小時后(如造模成功，記作停藥0天)，分別從模型組和空白對照組中各取2只大鼠，采用股動脈采血方法取3 mL血液，用于測定血液WBC(如造模成功，本次檢測結果記做藥物實驗0天)，WBC顯著降低則判定為造模成功，若未顯著降低則繼續注射環磷酰胺，直至造模成功。

1.4.2 動物分組與給藥 從造模成功后的模型大鼠中選取50只體況接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性別、體質量隨機分為模型組、富硒黃芪提取物高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg)、普通黃芪提取物組(200 mg/kg)，每組10只；另設10只健康大鼠為空白組。各組大鼠按100mg/(kg·d)劑量灌服相應藥物，模型組及空白組大鼠灌服等體積蒸餾水，1次/d，連續7天。

1.4.3 取材 給藥第7天后，各組大鼠禁食8小時，頸椎脫位法處死后股動脈取血，分離血清，-20℃保存，備檢。

1.4.4 指標檢測 1)處死大鼠后取出胸腺、脾臟，記錄質量變化，按“胸腺(mg)/體質量(g)、脾臟(mg)/體質量(g)”計算胸腺指數和脾臟指數。2)用酶聯免疫法(ELISA)檢測大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ 等免疫細胞因子含量。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 富硒黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺、脾臟指數的影響 與空白組比較，模型組大鼠胸腺指數及脾臟指數顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，各藥物干預組大鼠胸腺指數及脾臟指數有所升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指數、脾臟指數的影響(±s) mg/g

表1 黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指數、脾臟指數的影響(±s) mg/g

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 胸腺指數 脾臟指數空白組 1 0 0.7 0±0.1 5 3.0 1±0.4 5模型組 1 0 0.2 3±0.1 1#0.9 6±0.1 4#富硒黃芪提取物高劑量 1 0 0.5 0±0.0 9＊2.4 2±0.4 7＊富硒黃芪提取物中劑量 1 0 0.4 3±0.0 6＊1.9 5±0.5 4＊富硒黃芪提取物低劑量 1 0 0.4 0±0.0 5＊1.6 0±0.2 6＊普通黃芪提取物組 1 0 0.3 6±0.0 9＊1.4 9±0.4 5＊

2.2 富硒黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α表達水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量降低，TNF-α含量升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，各藥物干預組大鼠IL-2、IL-4、IFN-γ含量升高，TNF-α含量降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 富硒黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影響(±s) pg/mL

表2 富硒黃芪提取物對環磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影響(±s) pg/mL

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；＊表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 T N F-α I F N-γ I L-2 I L-4空白組 1 0 3 9.5 2±5.2 8 2 4.3 1±5.8 6 2 6 1.5 1±4 6.2 0 1 8.9 1±2.5 6模型組 1 0 7 0.1 4±6.6 8# 1 0.8 8±3.1 7# 1 5 3.7 4±3 4.9 6# 9.3 2±3.8 6#富硒黃芪提取物高劑量組 1 0 4 1.2 8±7.2 2＊ 2 0.9 0±5.1 8＊ 2 4 8.2 7±4 4.3 2＊ 1 8.1 6±1.7 4＊富硒黃芪提取物中劑量組 1 0 4 3.0 3±5.6 9＊ 1 9.1 0±4.8 1＊ 2 3 7.6 5±2 6.0 8＊ 1 7.6 5±2.2 6＊富硒黃芪提取物低劑量組 1 0 4 4.9 1±1 6.3 9＊ 1 7.6 5±4.2 3＊ 2 3 1.7 2±2 7.1 2＊ 1 6.8 7±1.8 3＊普通黃芪提取物組 1 0 5 2.0 4±7.4 2＊ 1 5.5 0±2.8 3＊ 1 9 0.9 0±1 9.3 6＊ 1 5.5 9±0.9 0＊

3 討論

免疫是人體的一種生理功能，人體依靠這種功能識別“自己”和“非己”成分，從而破壞和排斥進入人體的抗原物質，或人體本身所產生的損傷細胞和腫瘤細胞等，以維持人體健康。因此，免疫相關研究一直是醫學界的熱點課題，研究較多的是免疫抑制方面，主要針對開發免疫抑制藥物。在免疫抑制研究方面，動物模型的建立直接影響研究的結果，免疫抑制動物模型的建立，一般選用的藥物有環磷酰胺、長效糖皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、長春新堿、放線菌素等[9]，其中應用最廣泛，研究最多的一種建模藥物是環磷酰胺。環磷酰胺是一種細胞毒性藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，其能殺死有絲分裂和進入循環周期的細胞，破壞DNA結構，阻斷復制，有較強的免疫抑制作用。當免疫細胞受到抗原刺激后，它們在脾臟進行增殖分化，而胸腺是T細胞成熟的重要場所，因此，脾臟和胸腺的相對質量和免疫功能有關[10]。細胞因子在免疫系統中發揮重要作用，同時也是免疫調節的潛在靶點。脾臟是最大的外周免疫器官，受抗原刺激后，參與機體細胞和體液免疫的T細胞、B細胞和巨噬細胞大量增生，致脾濾泡增大，脾體積增大；而受到免疫抑制影響時淋巴組織萎縮，致脾體積縮小。因此，免疫器官指數說明了免疫器官的發育狀況，間接體現機體的免疫狀態。IL-2、IL-4是T細胞分泌的重要細胞因子，具有較強的免疫刺激作用，參與免疫應答和免疫調節，是衡量機體免疫功能，尤其是細胞免疫水平的重要標志。適量的TNF-α參與機體的正常免疫調節，是機體免疫防護的重要介質，分泌過多則參與機體的免疫病理損傷，導致某些疾病[11]。

近年，中醫藥在免疫方面的研究開展較多。黃芪是我國經典傳統補益中藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。味甘性溫，具有健脾補中、升陽舉陷、益衛固表、利尿、托毒生肌之功效。其主要有效成分為皂苷、多糖、黃酮等。楊小敏等[12]研究發現黃芪皂苷能增強小鼠腹腔巨噬細胞的免疫功能。黃芪多糖對于心腦血管疾病、內分泌疾病、泌尿系統疾病、免疫系統疾病等多種臨床疾病有積極的療效[13]。黃芪總黃酮具有抗損傷、抗突變、抗腫瘤和抑制動脈粥樣硬化等多種生物學效應[14]。鑒于藥用黃芪由于產地、采收季節和生長年限的不同而存在的差異，深入研究富硒黃芪的生物活性，加強深層次的研究具有重要的現實意義。劉必旺等[15]將黃芪藥渣發酵，得到產物富硒酵母，對免疫低下糖尿病模型動物進行不同藥物干預，結果發現富硒酵母可降低纖維蛋白原(FBG)和提高胰島素(INS)水平，同時可提高WBC，IgG及IL-2等免疫指標，黃芪藥渣發酵產物-富硒酵母具有降糖及提高免疫功能的作用。黃芪本身富含硒，具有降低心肌細胞對病毒易感性、調節細胞因子、刺激免疫球蛋白形成、激活T細胞、促進淋巴細胞分泌淋巴因子、增強淋巴細胞的細胞毒作用、提高機體免疫等重要功能[16]。另有研究[17]證實黃芪對小鼠腦和肝組織的脂質過氧化反應有明顯抑制作用，可增強血清、肝組織的硒含量，加強內源性氧自由基清除系統的功能，減少由自由基作用生成的脂質過氧化物。但目前國內外尚缺乏對培育的富硒黃芪的有關實驗及臨床研究。

本研究選用甘肅省渭源縣康榮中藥材專業合作社培育的新品種富硒黃芪為研究對象，通過觀察其對免疫抑制模型大鼠的影響，初步探討富硒黃芪對免疫功能的作用，為黃芪新品種的應用和開發提供科學依據。通過研究發現：環磷酰胺可引起大鼠免疫器官質量以及免疫細胞因子TNF-α含量升高，說明大鼠的免疫功能受到抑制。與模型組比較，各藥物干預組胸腺指數及脾臟指數有所升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示大鼠的免疫功能有所恢復，表明富硒黃芪提取物能顯著提高環磷酰胺所致免疫抑制模型大鼠的免疫功能，且這種作用較普通黃芪更為顯著。

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