卡納琳肝癌熱療療效的研究

曾廣富, 唐小海*, 黃源芳, 張雪梅

(1. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101; 2. 重慶萊美藥業股份有限公司, 重慶 401336)

熱療是通過吸熱材料吸收光能將其轉換成熱能,利用局部升溫殺死腫瘤達到治療惡性腫瘤的新型方法[1-2],是腫瘤治療中一種被廣泛研究的技術[3-5].該方法是針對腫瘤部位的治療,可以避免對其他組織造成損傷[6].

近紅外光(NIR)對生物組織無損害且具有一定的穿透力,可以作為熱療的重要光源[7],但是單純近紅外光的熱能遠遠不夠達到治療腫瘤的效果.因此各種光能的轉換功能性材料應運而生,例如金納米顆粒[8-10]、納米碳管[11-12]和磁性納米粒子[13]等.這些新穎的納米材料因其獨特的近紅外光吸收性和光穩定性,被迅速地開發和利用于熱療.納米碳作為熱療材料用于腫瘤治療得到較好的療效且無毒副作用[14].

光吸收納米材料卡納琳(CNSI)是以納米碳為原料制備的納米碳混懸注射液,顆粒直徑約為180 nm,具有高度的淋巴系統趨向性.CNSI作為中國唯一批準上市的淋巴結示蹤劑,在腫瘤研究應用以及臨床使用中[15-17],也有大量研究將其作為抗癌藥物載體[18-19].本文研究CNSI對肝癌模型作為吸熱材料的體外及體內的熱療療效.

1 材料和方法

1.1藥品試劑、儀器與細胞株藥品試劑:DMEM高糖培養基、青霉素鏈霉素溶液、PBS緩沖液、新生小牛血清(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司)、CNSI(重慶萊美藥業股份有限公司).

儀器:生物倒置顯微鏡(上海光學儀器廠)、培養箱(SANYO)、離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、超凈工作臺(蘇凈安泰)、水浴鍋(上海躍進醫療器械有限公司)、近紅外激光熱療儀.細胞株與動物:HepG-2(四川大學生物治療國家重點實驗室惠贈)、KM小鼠(成都達碩生物科技有限公司).

1.2方法

1.2.1細胞計數法檢測CNSI體外熱療抗腫瘤活性 取對數生長期的HepG-2肝癌細胞制成單細胞懸液.根據細胞計數的結果調整細胞濃度,取24個玻璃培養皿,每瓶加入1 mL(約3×104個細胞)放入37 ℃、體積分數為5%的 CO2孵箱.隔日加入用培養基稀釋的CNSI溶液(按培養基總體積將CNSI質量分數稀釋至50 μg/mL).

將實驗分為8組,分別為:對照組無處理,CNSI組加入50 μg/mL的CNSI,NIR組在1 W/cm2的NIR條件下連續照射3 d,每次3 min,實驗組(CNSI+NIR 0.2 W/cm2、CNSI+NIR 0.4 W/cm2、CNSI+NIR 0.6 W/cm2、CNSI+NIR 0.8 W/cm2、CNSI+NIR 1 W/cm2)加入50 μg/mL的CNSI ,連續照射3 d,每次3 min.NIR照射前加入CNSI溶液,實驗完成后用紅外熱像儀測量溫度.每次照射完成后更換培養基,最后一次照射后繼續培養2 d,用胰蛋白酶消化后計數,并計算

1.2.2CNSI體內熱療抗腫瘤活性 將KM小鼠32只隨機分為4組,小鼠右前腿部接種HepG-2肝癌細胞(2×106個/只),待腫瘤體積約100 mm3時進行治療.對照組無處理,CNSI組在腫瘤部位注射50 μL CNSI,NIR組在0.8 W/cm2的NIR條件下連續照射3 d,每次3 min,CNSI+NIR組在腫瘤部位注射50 μL CNSI,NIR為0.8 W/cm2的條件下連續照射3 d,每次3 min.

第一次治療完成24 h后,每組取一只小鼠,將腫瘤部位取出做病理切片.觀察、記錄小鼠腫瘤生長情況,每2～3 d用游標卡尺測量一次腫瘤體積.測量方式為按直角測量腫瘤的長軸a和短軸b,計算腫瘤體積為

V=ab2/2.

小鼠飼養條件均為溫度25 ℃、濕度60%、SPF級(無特定病原體),實驗過程均遵從實驗動物飼養管理條例及使用指南.實驗數據采用SPSS 22進行統計,以均數±標準差(X±S)表示.

2 結果與討論

2.1細胞層面的抑制作用NIR照射時細胞溫度上升不明顯,對細胞生長幾乎無影響.CNSI組也對細胞生長無影響.實驗組抑制率是隨著功率的升高而升高,CNSI+NIR 0.2 W/cm2抑制率為25.45%,CNSI+NIR 0.4 W/cm2抑制率為46.72%,CNSI+NIR 0.6 W/cm2抑制率為76.43%,CNSI+NIR 0.8 W/cm2抑制率為99.02%,CNSI+NIR 1 W/cm2抑制率為99.75%(如圖1).由此可以看出實驗組NIR條件為0.8 W/cm2時達到較為理想的治療效果.

圖 1 不同NIR功率細胞熱療結果

2.2體內抑制作用從病例圖片看出CNSI+NIR組腫瘤細胞大面積死亡達到預期治療效果(圖2(a)),NIR組對腫瘤細胞有一定的殺傷作用(圖2(b)),空白組與CNSI組腫瘤生長較好(圖2(c)和(d)).

CNSI對小鼠腫瘤的生長無影響,NIR組對腫瘤的抑制作用不明顯,而CNSI+NIR組對腫瘤生長有顯著抑制效果.

3次治療完成后,從腫瘤生長體積曲線(圖3(a))可以看出空白對照與CNSI組腫瘤生長趨勢基本一致,CNSI對腫瘤的整個治療過程均無影響;單NIR組前期有較小的抑制作用,但最后腫瘤仍然繼續生長且與空白組幾乎一致;CNSI+NIR組照射后腫瘤停止生長且30 d后仍未復發.空白組、CNSI組和NIR組小鼠腫瘤均無結痂, CNSI+NIR組小鼠治療10 d后腫瘤開始結痂,20 d后結痂脫落(圖

(a)近紅外+卡納琳

(b)近紅外

(c)對照

(d)卡納琳

圖2腫瘤組織病例切片圖

Fig.2Tumortissuecaseslice

3(b)).結痂證明了CNSI能夠吸收光能并將其迅速轉換為熱能,達到局部升溫的作用,從而殺死腫瘤細胞,而CNSI的示蹤性將其分散于整個腫瘤,使得腫瘤被全方位治療,腫瘤細胞死亡后形成結痂,然后逐漸脫落達到治療的作用.

3 結論

研究表明惡性腫瘤比正常細胞更易受熱刺激誘導細胞損傷和凋亡[20].功能性納米材料作為熱療的熱能轉換器備受廣大研究者的關注[14].

本研究選擇的CNSI具有光穩定性、結構均一以及良好的淋巴結示蹤性,注射到組織內的CNSI不進入血管,可迅速進入淋巴管或被巨噬細胞吞噬后進入毛細淋巴管,滯留、聚集在淋巴結,使淋巴結黑染,因此CNSI能夠有效聚集在腫瘤部位,其主要成分納米炭是良好的吸熱材料.

腫瘤部位注射CNSI后,在NIR為0.8 W/cm2的條件下治療小鼠肝癌模型,對各組的治療效果進行統計,結果顯示:CNSI+NIR(0.8 W/cm2)組具有顯著的抗腫瘤效果,可以明顯抑制腫瘤生長.CNSI作為光吸收納米材料,具有光穩定性強、近紅外特征吸收等顯著優點,可以有效地應用于腫瘤光熱治療方面.

圖 3 CNSI體內熱療示意圖

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