利用ISSR和SRAP分子標記技術構建紅優甜瓜指紋圖譜*

張永平范紅偉張文獻顧海峰陳幼源**

（1.上海市農業科學院園藝研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海奉賢201403；2.上海市農業技術推廣服務中心，上海閔行201103；3.上海市嘉定區農業技術推廣服務中心，上海嘉定201800）

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科甜瓜屬中的1個栽培種，是重要的經濟作物，國內外廣泛栽培。甜瓜在人工雜交制種過程中，因去雄不及時或不徹底，常混有母本自交系種子，同時甜瓜品種較為繁雜，且品種之間的植物形態非常接近，品種間的種子很難鑒別。傳統的甜瓜種子鑒別方法是通過表型特征來判斷，該方法耗時耗力；通過同工酶和種子蛋白電泳技術進行鑒別也受環境或甜瓜發育階段等影響，存在較大的缺點。而分子標記技術檢測的是在基因組DNA水平上的差異，不受外界環境的影響，因此檢測結果非常穩定[1]。在已建立的分子標記技術中，ISSR（簡單序列重復區間）標記是1種基于微衛星序列發展起來的十分有效的分子標記，具有模版需要量少、無需試劑盒、結果記錄方便、試驗成本低、操作簡單、試驗穩定性較高等優點[2]。Zhao等[3]利用ISSR標記構建了24個桑樹品種的指紋圖譜。SRAP（序列相關擴增多態性）是1種新型的基于PCR的標記系統，具有簡便、穩定、中等產率、可產生共顯性標記及便于克隆測序目標片段等特點，且擴增結果的多態性豐富[4]，已被應用于圖譜構建[5～6]。本研究采用ISSR和SRAP分子標記技術構建甜瓜雜交種紅優及其親本的DNA指紋圖譜，同時進行了與紅優相同類型的5個厚皮甜瓜品種的分子鑒別，旨在為保護研究者知識產權和消費者利益提供簡便快捷的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜瓜品種紅優及其親本種子，由上海市農業科學院園藝所提供；世農M103、精選紅妃、雪紅蜜和雪里紅種子（與紅優同為白皮紅肉類型的厚皮甜瓜品種），于種子市場購得。試驗所用的提取DNA、PCR試劑和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司，其中SRAP和ISSR引物序列詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取及檢測

采用改良過的CTAB法提取基因組DNA[7]。

1.2.2 PCR擴增及產物檢測

SRAP擴增反應采用20 μL的反應體系，其中25 mmoL/L MgCl22.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmoL/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，0.1 μmoL/L引物各3.0 μL，10ng/μL模板DNA 3.0 μL，滅菌雙蒸水6.4 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環；72℃延伸10 min后4℃保存[8]。

表1 SRAP和ISSR引物序列

ISSR擴增反應采用20 μL的反應體系，其中包含25 mmoL/L MgCl22 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmoL/L dNTP0.4 μL，5 U/μL Taq E 0.2 μL，10 ng/L模板DNA 3 μL，0.1 μmoL/L Primer 3 μL，滅菌雙蒸水9.4 μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環，72℃延伸10 min后4℃保存[8]。

PCR擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠（含EB）電泳分離，電壓120 v，時間約1.5 h，Gel DocTMEQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察并拍照分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

用40對SRAP和40個ISSR引物對供試材料進行PCR擴增，其中40對SRAP引物和15個ISSR引物均能得到較為穩定的擴增圖譜，但大多數引物的擴增結果在雙親及雜種之間是一致的，不能起到鑒別作用。最終篩選出1對SRAP特異引物（Me15-Em8）和2個ISSR引物（I-8和I-19）可將雜交種與其父母本分開；同時篩選出1個ISSR引物（I-19）可以將5個厚皮甜瓜品種一次性區分開，且重復性好。

2.2 擴增結果分析

圖1 不同引物對各參試厚皮甜瓜材料的擴增結果

表2 紅優甜瓜及其父母本SRAP和ISSR擴增特異譜帶

由圖1和表2可知，兩種標記共3個（對）引物（Me15-Em8、I-8和I-19）能在材料間表現出多態。SRAP引物Me15-Em8在約250 bp和280 bp處擴增出2條雙親的特異帶，在F1中2條特異帶也被擴增出來，表現出雙親間互補特征帶；ISSR引物I-8在約500 bp和550 bp處擴增出2條雙親的特異帶，在F1中2條特異帶也均存在；ISSR引物I-19在約480 bp和700 bp處擴增出2條雙親的特異帶，在F1中兩條帶均存在，而在F1中又擴增出1條約550 bp的特異帶區別于父母本。由此可見，3個（對）引物均能對供試材料的雙親和F1進行有效鑒別。

通過ISSR引物I-19對5個相同類型的甜瓜品種進行擴增，擴增結果如圖2和表3。在引物I-19指紋圖譜中，紅優比其他品種多1條約480 bp帶，即特異性標記為I-19-480 bp；世農M103比其他品種多1條約700 bp帶，即特異性標記為I-19-700 bp；雪里紅比其他品種多1條約280 bp帶，即特異性標記為I-19-280 bp；精選紅妃、紅優和雪里紅比雪紅蜜和世農M103兩個品種多1條約650 bp帶，而紅優、雪里紅和世農M103分別有特異標記I-19-480 bp、I-19～280 bp和I-19-700 bp。因此，可用I-19-650 p、I-19-480 bp和I-19-280 bp鑒別精選紅妃，可用I-19-650 p和I-19-700 bp鑒別雪紅蜜。

圖2 ISSR引物I-19對5個甜瓜品種的擴增結果

表3 引物I-19對5個甜瓜品種ISSR擴增特異譜帶

3 討論

當前農業生產中，品種混雜退化現象普遍，如假種混入種子市場，育種專家的權益和農民的利益則會受到嚴重損害。目前許多園藝植物育種所使用的材料越來越集中于少數優良品種或品系，使得選育出的新品種在更多的性狀上更加相似，難以區分?，F代分子生物學的發展為建立快速、準確、實用的種子質量鑒定體系提供了技術支撐，基因分子標記的作物DNA指紋圖譜分析技術應運而生，并取得了快速發展。在已建立的分子標記技術中，ISSR和SRAP分子標記技術通常都是顯性或共顯性標記[9]，所以父母本具有的特征帶在雜種F1代中通常也能表現出來。通過檢測F1代是否出現雙親的特異帶進行雜種鑒定，目前已被廣泛應用于多種作物的種子純度鑒定[10～12]。本試驗成功篩選出1對SRAP引物和2個ISSR引物，可擴增出紅優甜瓜雙親的互補特征帶。因此，兩種標記技術均適用于甜瓜的指紋圖譜構建，都能有效鑒別甜瓜品種雙親及其雜種F1，可用于雜種純度鑒定。同時，在本研究中僅用1個ISSR引物即可鑒別出與紅優相同類型的5個甜瓜品種，充分體現了ISSR技術的高效性，為紅優甜瓜品種鑒別提供了有效、可靠的方法，在分子水平上為該品種的知識產權提供了技術保障。

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