慢性乙型肝炎患者血清IL-17表達水平及其調控IL-6/STAT3信號通路的研究

柳雅慧，任麗，邵潔，侯永旺，常嬌

乙型肝炎病毒（HBV）是最常見的肝炎病毒，嚴重危害人類健康。據估計全世界有 3.5 億人為慢性乙型肝炎（CHB）感染者。當 HBV 感染人體后，人體免疫系統啟動多種免疫反應以清除或減弱HBV 對人體的損害。T 輔助細胞 17（Th17）是發揮促炎活性的新興 T 細胞亞群，主要分泌 IL-17。IL-17 與其受體結合后可以誘導 IL-6、IL-1、TNF-α等炎性細胞因子與趨化因子的分泌，促進炎癥反應[1]。最近的研究發現，IL-17 廣泛參與慢性肝病的肝臟損傷[2]，同時 IL-17 的表達與慢性乙型肝炎炎癥活動度及肝纖維化程度呈顯著正相關[3]，但IL-17 在 CHB 患者中的調控機制尚未明確。

本文擬在探究 IL-17 在 CHB 患者中的表達水平，以及其是否通過調控 IL-6/STAT3 信號通路參與肝炎疾病的進展，從而探究 IL-17 在 CHB 疾病中的意義。

1 材料與方法

1.1 對象及材料

1.1.1 對象 在患者的知情同意下，收集 50 例CHB 患者全血并分離血清，–80 ℃ 保存備用。實驗組入選標準：乙型肝炎病毒抗原（HBsAg）陽性。排除標準：甲、丙、丁、戊型肝炎患者，獲得性免疫缺陷綜合征患者，自身免疫性疾病患者以及患有其他慢性肝臟損害疾病患者，接受保肝及抗病毒治療患者。選取同一時期 50 名性別和年齡與實驗組匹配的門診健康體檢者作為對照受試者。回顧性收集入選對象臨床特征與病毒學特征信息。

1.1.2 試劑 I2000 配套試劑購于美國雅培公司；胎牛血清、DMEM 培養基均購于美國 Gibco 公司；遺傳霉素（G418）購于德國 Merck 公司；IScriptTMcDNA 合成試劑盒購于美國 Bio-Rad 公司；ELISA 試劑盒購于中國武漢基因美生物科技公司；細胞裂解緩沖液（RIPA）購于北京索萊寶公司；蛋白定量分析試劑盒購于美國 Thermo 公司；硝酸纖維素膜購于英國 GE Healthcare 公司；抗體購于英國 Abcam 公司；電化學發光法（ECL）蛋白質印跡試劑購于美國 Millipore 公司。

1.1.3 儀器 PE9700 實時熒光定量檢測儀為美國 PE公司產品；全自動生化分析儀 AU5800 為美國 Beckman 公司產品；Roche E170 電化學發光免疫分析儀為瑞士 Roche 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 生化指標檢測 采用美國雅培 I2000 及配套試劑檢測乙型肝炎病毒標志物 HBsAg、HBeAg、HBcAb（化學發光法）；采用 PE9700 實時熒光定量檢測儀以及配套試劑檢測血清 HBV-DNA 含量；采用全自動生化分析儀 AU5800 以及配套試劑連續監測法檢測 ALT、AST，重氮試劑法檢測總膽紅素、直接膽紅素，雙縮脲法檢測總蛋白，溴甲酚綠法檢測白蛋白；采用電化學發光法檢測甲胎蛋白含量，嚴格按照儀器和試劑說明書進行操作，質量控制結果均在控。

1.2.2 細胞培養 HepG2.2.15 細胞培養于含有10% 胎牛血清和 400 μg/ml 遺傳霉素（G418）的DMEM 培養基中；在含 5% CO2，37 ℃ 孵育箱中培養。參考文獻[4]的研究方法，將細胞接種于 6 孔板中并用不同濃度（0、40 ng/ml）的 rhIL-17處理。根據 HBV 一個復制周期約為 48 h，常用的檢測時間點為 3 d，所以當 rhIL-17 處理3 d 后，收集細胞以及細胞上清。

1.2.3 實時熒光定量 PCR 利用IScriptTMcDNA合成試劑盒將提取的 RNA 逆轉錄為 cDNA。使用Fast Start Universal SYBR Green Master 進行 IL-6 mRNA 的相對定量，并將 β-actin mRNA 用作內參。用 2-ΔΔCT方法計算靶基因的倍數變化。實驗引物的序列如下：IL-6 mRNA 上游引物 5' TCCAAA GATGTAGCCGCCC 3'，下游引物 5' CAGTGCCTC TTTGCTGCTTTC 3'；β-actin 上游引物 5' CTCTTC CAGCCTTCCTTCCT 3'，下游引物 5' AGCACTGT GTTGGCGTACAG 3'。

1.2.4 酶聯免疫吸附法 根據生產商的說明書，通過 IL-17、IL-6 ELISA 試劑盒分別測定 CHB 患者血清中 IL-17 水平以及細胞上清中 IL-6 濃度。1.2.5 蛋白免疫印跡 收集細胞并用適當體積的含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩沖液（RIPA）裂解細胞。通過蛋白定量分析試劑盒定量蛋白質，含有 30 μg 總蛋白的裂解物在 99 ℃ 變性 10 min。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，通過電濕轉移法將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜。將含有目的蛋白質的膜用 5% 脫脂牛奶封閉 1 h，并在 4 ℃ 下與一抗（STAT3 1:2000；pSTAT3 1:2000；Actin 1:10000）一起溫育過夜。第2 天，將膜在含有吐溫-20 的三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBS-T）中洗滌 5 min，并重復 3 次。與二抗（1:10000 稀釋）在室溫下孵育 1 h。用電化學發光法蛋白質印跡試劑顯示條帶。肌動蛋白（Actin）為對照。

1.3 統計學分析

采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。采用中位數及四分位數間距表示受試者的臨床特征以及病毒學特征，兩組之間的差異通過Manne-Whitney 秩和檢驗來評估。采用 Spearman相關分析方法分析 IL-17 與 HBV-DNA、ALT 及AST 之間的相關性。采用t檢驗分析 rhIL-17 未處理細胞組與處理細胞組之間的差異。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

表1 受試者基本臨床及病毒學特征（n = 50）Table 1 Clinical and virological characteristics of the subjects enrolled in the study (n = 50)

2 結果

2.1 CHB 患者和健康對照者的臨床以及病毒學特征

收集了 50 名 CHB 患者和 50 名年齡和性別匹配的健康對照者的臨床和病毒學特征，具體數據見表 1。血清 ALT、AST、總膽紅素、直接膽紅素、甲胎蛋白在 CHB 患者組中明顯高于健康對照組，血清總蛋白、白蛋白在CHB 患者組中明顯低于健康對照組。

2.2 IL-17 與 HBV 的相關性

與健康對照組相比，CHB 患者組血清中 IL-17的水平明顯升高（圖 1A），同時我們發現 CHB 患者血清中 IL-17 與 HBV-DNA 水平[log10（HBV DNA）]呈正相關性（圖 1B）。

2.3 IL-17 與肝臟損傷指標 ALT、AST 之間的相關性

將CHB 患者血清 IL-17 水平與血清中 ALT、AST 濃度進行相關性分析發現，IL-17 水平與ALT、AST 濃度呈顯著的正相關性（圖 2A、B）。

2.4 IL-17 參與并激活 IL-6/STAT3 信號通路

將能進行 HBV 復制的 HepG2.2.15 細胞系用 rhIL-17 處理 3 d 后，檢測細胞中 IL-6 mRNA以及上清中 IL-6 蛋白的表達水平，發現用 rhIL-17處理細胞后，IL-6 表達水平明顯上調（圖 3A、B）。同時我們發現磷酸化的 STAT3 在用 rhIL-17 處理后表達水平也明顯上調（圖 3C）。

圖1 IL-17 與 HBV 相關性（A：健康對照組與 HBV 患者組中血清中 IL-17 濃度；B：CHB 患者血清中 IL-17濃度與HBV-DNA 水平之間的相關性）Figure 1 The relationship between the level of IL-17 and HBV (A: The serum levels of IL-17 in healthy control and chronic HBV patients; B: The correlation between IL-17 levels and the concentrations of HBV-DNA in CHB patients)

圖2 IL-17 水平與肝臟損傷指標 ALT（A）和 AST（B）濃度之間的相關性Figure 2 The correlations between IL-17 level and the concentrations of ALT (A) and AST (B) were analyzed by Spearman’s rank test

圖3 IL-17 參與并激活 IL-6/STAT3 信號通路（A：IL-6 mRNA 在未用 rhIL-17 處理細胞組以及用 40 ng/ml rhIL-17 處理細胞組中的相對表達量；B：收集未用 rhIL-17 處理細胞組以及處理組的細胞上清，采用 ELISA 法檢測 IL-6 蛋白的表達水平；C：收集未用 rhIL-17 處理細胞組以及處理組的細胞，檢測細胞中 STAT3、pSTAT3 蛋白的表達水平）Figure 3 IL-17 is involved in and activates the IL-6/STAT3 signaling pathway (A: Relative real-time PCR was performed to determine the level of IL-6 mRNA after 3 days treatment; B: ELISA was performed to determine the level of IL-6 protein after 3 days treatment; C: Western blot was performed to determine the level of STAT3 protein and pSTAT3 protein after 3 days treatment)

3 討論

乙型肝炎是一種分布范圍廣、感染率高、難治愈的疾病，嚴重危害人類健康。HBV 感染人體后可誘發免疫反應間接損害肝細胞。其中在機體免疫過程中，Th17 細胞在 HBV 感染的發病機制中起重要作用[5]，而 IL-17 是 Th17 細胞分泌起主要免疫作用的細胞因子。研究發現 IL-17 與 CHB 患者之間具有相關性，但具體的機制尚無明確報道，因此在本文中，我們探究了 IL-17 在 CHB 患者中的表達水平以及其與 IL-6/STAT3 信號通路的關系。

我們的研究發現，與健康對照組相比，IL-17 在CHB 患者中明顯升高，表明 IL-17 與 CHB 患者之間具有相關性，將 IL-17 與 CHB 患者血清中HBV-DNA 進行相關性分析發現，兩者呈明顯的正相關性，提示升高的 IL-17 可以抑制機體對 HBV的免疫清除作用，IL-17 可能參與了 HBV 感染時HBV 的復制與表達，導致 CHB 患者免疫系統功能紊亂加重，從而引起肝臟損傷加重。有學者同樣發現 IL-17 在 CHB 患者中明顯升高，導致患者肝功能受損[3]。我們還發現 IL-17 與肝臟損傷指標ALT、AST 之間呈顯著的正相關性，說明隨著 CHB患者肝功能受損程度的增強，IL-17 水平變化顯著。Zhang 等[6]發現 IL-17 陽性的細胞在 CHB 患者的肝臟小葉和門靜脈區的表達水平與健康對照組相比明顯升高，并隨著肝臟損傷強度的增強而表達增高。以上結果表明，IL-17 協同其他促炎因子，加劇肝臟炎癥微環境，參與 HBV 的復制，在 CHB患者疾病進展中發揮重要作用。

IL-17 不僅在 CHB 患者疾病中發揮重要作用，同時有研究發現，IL-17 可以參與 HBV 相關的肝硬化、肝癌的進展[7-8]。在我們的研究中發現，rhIL-17 作用于能進行 HBV復制的細胞時，檢測到 IL-6 mRNA 以及蛋白水平上調；而 IL-6 可調控Th17 細胞的分化，促進 Th17 細胞分泌 IL-17[9]，這樣 IL-17 與 IL-6 之間通過相互促進作用，共同調控機體的免疫反應。同時 IL-6 可介導肝癌細胞中 STAT3 的激活，活化的 STAT3 可介導抗凋亡，促進增殖和促進血管生成的發生[10]。在此研究背景下，我們發現能進行 HBV 復制的細胞在 rhIL-17作用后，pSTAT3 水平顯著升高，pSTAT3 可能通過抗凋亡、促進增殖的功能參與 HBV 持續在體內復制的過程。同時有研究發現 IL-17 通過激活IL-6/STAT3 信號通路還可促進肝癌的侵襲與轉移[4]。以上結果表明，IL-17 參與并激活 IL-6/STAT3 信號通路，與 CHB 疾病的進展密切相關。

綜上所述，我們發現 IL-17 在 CHB 患者中明顯升高，同時 IL-17與 HBV-DNA 病毒載量之間呈正相關性，并且 IL-17 參與并激活 IL-6/STAT3信號通路，從而與 HBV 復制及 CHB 疾病的進展密切相關。因此，通過降低患者體內 IL-17 的表達水平，或者阻斷 IL-6/STAT3 信號通路對于控制慢性乙型肝炎的進展極有可能具有非常重要的作用，為未來 CHB 患者的治療提供了新的思路。本文存在樣本量偏小的局限性，并且 IL-17 參與 HBV 復制的詳細機制，如是否通過促進 HBV 復制中間體、前基因組 RNA 的表達而促進 HBV 復制等，還需要進一步的研究。

[1] Kolls JK, Lindén A. Interleukin-17 family members and inflammation.Immunity, 2004, 21(4):467-476.

[2] Lafdil F, Miller AM, Ki SH, et al. Th17 cells and their associated cytokines in liver diseases. Cell Mol Immunol, 2010, 7(4):250-254.

[3] Wang L, Chen S, Xu K. IL-17 expression is correlated with hepatitis B-related liver diseases and fibrosis. Int J Mol Med, 2011, 27(3):385-392.

[4] Gu FM, Li QL, Gao Q, et al. IL-17 induces AKT-dependent IL-6/JAK2/STAT3 activation and tumor progression in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 2011, 10:150.

[5] Wu W, Li J, Chen F, et al. Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients.J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(4):750-757.

[6] Zhang JY, Zhang Z, Lin F, et al. Interleukin-17-producing CD4(+) T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B. Hepatology, 2010, 51(1):81-91.

[7] Du WJ, Zhen JH, Zeng ZQ, et al. Expression of interleukin-17 associated with disease progression and liver fibrosis with hepatitis B virus infection: IL-17 in HBV infection. Diagn Pathol, 2013, 8:40.

[8] Liao R, Sun J, Wu H, et al. High expression of IL-17 and IL-17RE associate with poor prognosis of hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res, 2013, 32:3.

[9] Zhou L, Ivanov II, Spolski R, et al. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat Immunol, 2007, 8(9):967-974.

[10] Yu H, Kortylewski M, Pardoll D. Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment. Nat Rev Immunol, 2007, 7(1):41-51.