波拉霉素發酵工藝的優化

孫正陽，呂廣新，孟浩毅，趙晨，楊兆勇，陳靜

波拉霉素（圖 1）是吸水鏈霉菌 LP93（Streptomyces hygroscopicusLP93）發酵培養物經酸化、過濾，菌體用溶劑提取、層析等方法分離提取得到的具有很高抗真菌活性的多羥基內酯類新抗生素[1]。該抗生素是由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所首次發現的一種新結構天然抗菌化合物，具有廣譜抗微生物活性，對酵母菌、絲狀真菌、原蟲、革蘭陽性細菌均有活性，是一類廣譜抗真菌抗生素[2]。另外，其產生菌原始菌株的生物學效價已穩定達到 3000 μg/ml，具有較好的應用價值。因此，建立波拉霉素商品化生產的小型中試發酵工藝對于其應用技術的研究是十分關鍵的。

本研究通過對波拉霉素發酵培養基成分及發酵條件進行優化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進行波拉霉素發酵液活性測定，獲得最優的發酵條件，以利于提高其生物學效價，為波拉霉素的應用研究提供物質基礎。

圖1 波拉霉素結構圖Figure 1 The structure of polaramycin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 超凈工作臺購自蘇州匯通空調凈化工程有限公司；CR22GIII 型高速離心機購自日本 Hitachi 公司；高壓滅菌鍋購自日本 Hirayama公司；ZHWY-3212 自控搖床、37 ℃ 和 28 ℃ 培養箱均購自上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.1.2 產生菌和培養基 波拉霉素產生菌、枯草芽孢桿菌 63501 由本實驗室保存；斜面培養基：天門冬素 0.05%、K2HPO40.05%、葡萄糖 1%、瓊脂 1.2%；種子培養基：黃豆餅粉 2% ～ 4%、(NH4)2SO40.3%、CaCO30.15%、葡萄糖 2%；基礎培養基 1（用于進行氮源及輔助氮源的優化）：葡萄糖 3.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；基礎培養基 2（用于進行碳源的優化）：黃豆餅粉 3.0%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；發酵培養基（用于進行消泡劑添加及發酵中補料實驗）：黃豆餅粉 3.0%、葡萄糖 3.5%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；檢定培養基 I（上層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂 1%、pH 7.0；檢定培養基 II（下層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂2%，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發酵方法 取新鮮波拉霉素產生菌斜面，采用挖塊法接種于裝有 50 ml 種子培養基的250 ml 三角瓶中，于 28 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養 48 h，再以體積分數 10% 的接種量接入裝有50 ml 發酵培養基的 500 ml 三角瓶中，于 25 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養。

1.2.2 波拉霉素活性測定

1.2.2.1 雙碟的制備 取直徑約 90 mm、高 16 ～17 mm 的平底雙碟，注入加熱融化的檢定培養基 II 20 ml，使其在碟底均勻攤布，放置水平臺上凝固，以此作為底層。另取檢定培養基 I 適量加熱融化后，放冷至 48 ～ 50 ℃，加入 1% 枯草芽孢桿菌菌懸液，充分搖勻后用滅菌大口吸管在每個雙碟中分別加入 5 ml，使其在底層上均勻攤布，作為菌層，放置水平臺上冷卻后備用。

1.2.2.2 波拉霉素產生菌發酵液的活性測定 精密吸取波拉霉素產生菌發酵液1 ml，加入 1 ml 乙酸乙酯，充分混勻，取乙酸乙酯提取液進行測定。在每一個雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內徑 6.0 mm，高 10.0 mm，外徑 7.8 mm）6 個，加入 200 μl 各組乙酸乙酯提取液，置于 37 ℃ 培養18 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 氮源及輔助氮源對波拉霉素發酵的影響 以原發酵培養基中添加黃豆餅粉 3.0% 為對照，分別用黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + 酵母膏 0.5%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5%、魚粉 2.2% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% + KNO30.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4NO30.2%、黃豆餅粉 3.0% + NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、玉米漿 2.0% + (NH4)2SO40.5% 作為氮源及輔助氮源添加至基礎培養基 1 中，進行菌株的發酵，分別于發酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適氮源。

1.2.4 碳源對波拉霉素發酵的影響 以原發酵培養基中添加葡萄糖 3.5% 為對照，分別用淀粉3.5%、蔗糖 3.5%、乳糖 3.5%、果糖 3.5%、甘油3.5%、糊精 3.5%、豆油 3.5%、玉米粉 3.5%、淀粉 3.0% + 葡萄糖 0.5% 作為碳源添加至基礎培養基 2 中，進行菌株的發酵，分別于發酵 72 h 及96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適碳源。

1.2.5 消泡劑對波拉霉素發酵的影響 以發酵過程不添加消泡劑為對照，分別用豆油（0.1%、0.3%、0.5%）、泡敵（0.01%、0.03%、0.05%）及豆油 + 泡敵（0.1% + 0.01%、0.3% + 0.03%、0.5% + 0.05%）作為消泡劑添加至發酵培養基中進行菌株的發酵，分別于發酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定消泡劑對波拉霉素發酵的影響。

1.2.6 波拉霉素發酵的補料實驗 在波拉霉素發酵過程中分別在不同發酵時間補加不同的培養基成分，以發酵過程不進行補料為對照，測定抑菌活性，確定波拉霉素中試發酵的最佳補料條件。

1.3 統計學處理

3 次及以上的獨立實驗數據結果以±s表示。所有數據均采用 ANOVA 分析和t檢驗，P＜0.05 即認為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同氮源對波拉霉素發酵的影響

利用發酵液抑菌活性評價 12 種不同氮源及輔助氮源對波拉霉素發酵的影響。結果如圖 2 所示，發酵 72 h 時，以花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + NH4NO30.2% 作為氮源效果最佳。而當發酵 96 h 時，以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5% 作為混合氮源添加時，波拉霉素產生菌發酵液抑菌活性提高最為明顯。

2.2 不同碳源對波拉霉素發酵的影響

由 10 種不同碳源對波拉霉素發酵的影響結果（圖 3）可知，無論是 72 h 還是 96 h，波拉霉素發酵的碳源以果糖最佳，葡萄糖次之，豆油最差。

2.3 消泡劑對波拉霉素發酵的影響

結果如圖 4 所示，從發酵發展趨勢可以看出豆油和泡敵添加量為 0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發酵幾乎無影響。

在考慮以上因素進行研究的同時，各組實驗均分別在發酵 72 h 和 96 h時取樣，對不同發酵時間進行考察，結果發現發酵 96 h 較 72 h 抑菌活性提高明顯，因此確定波拉霉素的最佳發酵時間為96 h。

圖2 不同氮源對波拉霉素發酵的影響Figure 2 The effect of different nitrogen sources on the fermentation of polaramycin

圖3 不同碳源對波拉霉素發酵的影響Figure 3 The effect of different carbon sources on the fermentation of polaramycin

圖4 消泡劑的添加對波拉霉素發酵的影響Figure 4 The effect of adding defoamer on the fermentation of polaramycin

圖5 補料方式對波拉霉素發酵的影響Figure 5 The effect of feeding method on the fermentation of polaramycin

2.4 波拉霉素發酵的補料實驗

在上述實驗基礎上對波拉霉素發酵過程中的補料方式進行了探討，結果如圖 5 所示，波拉霉素在發酵 72 h 時補加 1% 葡萄糖和 0.5% 黃豆餅粉效果最佳。

3 討論

氮源在微生物發酵中起著重要作用，為微生物提供基本的營養物質及生長因子等重要物質，不僅供應菌體生長和維持生命活動，還和代謝產物的生物合成密切相關[3]。黃豆餅粉是初始發酵培養基中的唯一氮源，因此本研究對 12 種不同氮源及輔助氮源進行考察，綜合考慮中試發酵成本、穩定性及酸堿性等因素，最終以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5% 作為培養基的最佳氮源。

碳源是微生物發酵培養基中最重要的能源物質之一，它能夠為微生物的生長及抗生素的合成提供能量及碳元素，因此對于微生物的生長發育具有決定性的作用[4]。因此在上述實驗的基礎上，考察10 種不同碳源對波拉霉素發酵的影響，綜合考慮中試發酵工藝，最終以原培養基中葡萄糖 3.5% 作為波拉霉素發酵的碳源。

在液體發酵過程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸增大以及培養基中代謝產物積累等原因，發酵液會產生大量的泡沫[5]，泡沫嚴重時，極易造成發酵液漫罐、雜菌污染及代謝異常等不利影響[6]。然而，適當的泡沫形成對抗生素發酵氧傳遞速率（OTR）的提高有顯著作用，因此篩選適合的消泡劑對泡沫適量控制是波拉霉素發酵過程中的重要環節之一[7]。通常消泡的方法包括物理方法（如機械攪拌、靜電消泡、冷凍法等）和化學方法[6]。化學方法通過消泡劑的添加來減少或控制泡沫，經濟方便且效果好，目前在液體發酵工業生產中得到了廣泛應用[8]。化學消泡劑的添加對微生物菌體生長會產生一定影響，可能會降低或抑制發酵微生物的生長和產量[9]。因此本研究考察兩種不同消泡劑（豆油和泡敵）及不同添加濃度對波拉霉素發酵的影響，結果表明添加一定量的豆油和泡敵對波拉霉素發酵幾乎無影響。

補料培養作為一種介于連續培養和分批培養之間的發酵方式，是指在發酵過程中，連續或間歇補加一種或幾種培養基成分，但不同時取出發酵液的發酵方法[10]。其具有提高菌體對氧和營養成分的利用率、緩和培養基底物抑制等特點，從而更有利于目的產物的生成，達到較大幅度提高產量的目的，目前已被廣泛應用到各種發酵初級和次級代謝產物的生產中[11-12]。因此本研究對波拉霉素發酵過程中的補料方式進行了探討，確定了其最佳補料方式。

綜上所述，本研究通過對波拉霉素發酵培養基成分及發酵條件進行優化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進行活性測定，確定波拉霉素發酵最優的氮源為黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、最佳碳源為葡萄糖 3.5%、發酵 72 h 時補加 1% 葡萄糖和 0.5%黃豆餅粉、最終發酵 96 h，且豆油和泡敵添加量為0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發酵無影響。本研究為波拉霉素中試發酵條件的確定提供了依據，進而為其應用研究提供物質基礎。

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