抗CD19 CAR-T對(duì)K562CD19+腫瘤細(xì)胞特異性殺傷作用的研究

高鵬，李玉霞，賈凡，扈江偉，喬雪輝，王煒，凌焱，陳惠鵬

合成生物學(xué)旨在以人工手段制造生物系統(tǒng)[1]，其中一個(gè)重要發(fā)展方向是模擬和新建生物信號(hào)通路并實(shí)現(xiàn)新的生物學(xué)功能。合成生物學(xué)經(jīng)過多年的快速發(fā)展，產(chǎn)出了新型的研究工具和治療方案[2]。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CAR）修飾的 T 淋巴細(xì)胞（CAR-T）就是利用合成生物學(xué)思路搭建信號(hào)通路形成的治療方案，其應(yīng)用已經(jīng)在癌癥治療方面展現(xiàn)出巨大的前景并得到美國(guó)FDA 批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用[3]。CAR-T 按照合成生物學(xué)的基本設(shè)計(jì)原則在安全性和可控性方面不斷取得新的進(jìn)展[4]。

急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的 20% 兒童患者和 65% 成人患者存在化療耐藥性，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)[5]。新型的治療方案需要繞過藥物抵抗才能顯著提高治療指數(shù)。由此，細(xì)胞治療作為一種新型的治療方案由于出色的療效令人矚目，其有效緩解率優(yōu)于現(xiàn)有的經(jīng)典療法[6]。

通過人工修飾的方式可以改變 T 淋巴細(xì)胞的免疫殺傷靶向性，即在 T 細(xì)胞上修飾人造的免疫受體從而特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞并激活 T 細(xì)胞，其高效的靶向性使 T 細(xì)胞毒性特異性針對(duì)腫瘤細(xì)胞，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，避免正常組織受到影響[7]。人造的嵌合抗原受體通常包括胞外的抗體來(lái)源單鏈可變結(jié)構(gòu)域（single-chain variable fragment，scFv）和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。對(duì)于 ALL 細(xì)胞，CD19 表面抗原分子在高達(dá) 95% 的 B 細(xì)胞腫瘤上表達(dá)[8]。而且這種高表達(dá)是特異性的，不在正常的非造血細(xì)胞上表達(dá)，造血細(xì)胞中也僅僅在 B 淋巴細(xì)胞系表達(dá)，這使得 CD19 分子成為一個(gè)極具吸引力的靶向治療抗原[9]。單純的 CD3ζ 信號(hào)不足以激活 T 細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，根據(jù) T 細(xì)胞激活的雙通路理論，還需要添加共刺激信號(hào)分子，比如 4-1BB 分子[10]。

在本項(xiàng)研究中，我們探究了靶向 CD19 分子的嵌合抗原受體修飾的 T 淋巴細(xì)胞對(duì)于 CD19 細(xì)胞的特異性殺傷作用。結(jié)果表明，抗 CD19 CAR-T 細(xì)胞能夠特異性地被 CD19 表型陽(yáng)性的細(xì)胞激活，并且在較低的效靶比時(shí)即對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 DH5α、293T 細(xì)胞、K562 細(xì)胞、K562CD19+細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI1640、DMEM、青霉素/鏈霉素、胎牛血清均為美國(guó) Gibco公司產(chǎn)品；DNA 聚合酶、DNA marker、限制性內(nèi)切酶為美國(guó) NEB 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒大提試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液 Ficoll-Paque PLUS 購(gòu)于美國(guó) GE 公司；聚凝胺、聚乙烯亞胺為美國(guó) Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；IL-2 ELISA kit為美國(guó) BD 公司產(chǎn)品；Cyto Tox96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó) Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 CD19-CAR 載體的構(gòu)建 按照融合表達(dá)的設(shè)計(jì)，把 EGFP 與 CD19 CAR 分子通過自剪切的F2A 分子相連接。其中，CD19 CAR 分子通過融合PCR 技術(shù)將識(shí)別 CD19 分子的單鏈抗體片段CD19-ScFv 與協(xié)同共刺激分子 4-1BB 和胞內(nèi)傳遞信號(hào)的 CD3ζ 串聯(lián)。構(gòu)建到慢病毒表達(dá)載體pLenti-EF1α 上，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確克隆即命名為 pLenti-EGFP-CD19-CAR。

1.2.2 慢病毒包裝、濃縮 在 15 cm 培養(yǎng)皿中接種 5 × 106293T 細(xì)胞，在 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。當(dāng)匯合度達(dá)到 60% ～ 70% 時(shí)，即可進(jìn)行慢病毒包裝的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，制備轉(zhuǎn)染 DNA 復(fù)合物：在 2 ml PBS 中加入 10 μg pLenti-EGFP-CD19-CAR、5 μg pMDL g/pRRE 慢病毒包裝載體質(zhì)粒、2.5 μg pRSV-Rev 載體質(zhì)粒、2.5 μg pMD2.G 載體質(zhì)粒，混勻后加入 18 μl 聚乙烯亞胺（100 μmol/L），再次混勻后室溫靜置 10 min即可轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 收集含有病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)過 0.45 μm 過濾膜過濾后采用超速離心法（24 000 r/min，2 h）濃縮慢病毒顆粒，重懸后分裝保存在 –80 ℃ 超低溫冰箱。

1.2.3 T 細(xì)胞分離與修飾 采用 Ficoll 分離法獲取人外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞 PBMC，并用X-VIVO 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。用抗 CD3/CD28 抗體和 IL-2 激活 T 細(xì)胞，第2 天用濃縮過的病毒感染。在適量體積的無(wú)血清的 X-VIVO 中加入聚凝胺至終濃度為 8 μg/ml，用該培養(yǎng)基重懸離心收集的 T 細(xì)胞，并以 5 × 105個(gè)/孔的密度接種在6 孔板中。根據(jù)病毒滴度與細(xì)胞數(shù)目，加入 MOI =30 的慢病毒濃縮液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板以混勻。其后每 3 天補(bǔ)充培養(yǎng)基和 IL-2，在第14 天左右進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.4 ELISA 檢測(cè) IL-2 的表達(dá) 取 K562 細(xì)胞與 K562CD19+細(xì)胞，按照 1 × 105個(gè)/孔濃度接種于U 型 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并按照效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞 = 2:1 的比例接種 primary-T 或 CD19 CAR-T細(xì)胞。將 96 孔板置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后使用 ELISA 試劑盒測(cè)定上清中的 IL-2 含量，具體操作詳見說(shuō)明書。

1.2.5 乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) T 細(xì)胞殺傷作用 同 IL-2 測(cè)定，共孵育培養(yǎng) 24 h 后，使用 Cyto Tox96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)物 LDH 釋放量，具體操作詳見說(shuō)明書。細(xì)胞殺傷率 =（實(shí)驗(yàn)組釋放量 – 效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放量 – 靶細(xì)胞自發(fā)釋放量）/（靶細(xì)胞最大釋放量 –靶細(xì)胞自發(fā)釋放量）× 100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Tukey 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α = 0.05，P≤ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲得抗 CD19 嵌合抗原受體慢病毒載體

利用融合 PCR 的方法把報(bào)告基因 EGFP 與抗 CD19 的 CAR 分子用自剪切的 F2A 分子連接。在細(xì)胞中表達(dá)后 EGFP 蛋白從融合蛋白上切割下來(lái)留在胞內(nèi)，CAR 分子則在導(dǎo)肽的作用下定位在細(xì)胞膜上。抗 CD19 CAR 分子片段包括對(duì)CD19 表面抗原具有特異性的單鏈抗體片段，共刺激因子 4-1BB 片段和細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的 CD3ζ區(qū)域（包含 3 個(gè)ITAM 區(qū)域）。為了保證 CAR 分子在 T 細(xì)胞中高效穩(wěn)定地表達(dá)，將 EGFP-CAR 分子克隆到 pLenti-EF1α 慢病毒載體上，質(zhì)粒抽提后經(jīng)過酶切和測(cè)序結(jié)果表明，完全符合預(yù)期結(jié)果。

圖1 慢病毒包裝鏡檢結(jié)果Figure 1 Protein expression in 293T cell transfected with lentivirus by GFP fluorescence assay

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CAR-T 陽(yáng)性細(xì)胞百分比（A：Primary-T 細(xì)胞散點(diǎn)圖；B：Primary-T 細(xì)胞熒光分布；C：CAR-T 細(xì)胞散點(diǎn)圖；D：CAR-T 細(xì)胞熒光分布）Figure 2 Transfection rate of CAR in T cells assayed by flow cytometry (A: Primary-T flow cytometry scatter plot; B: Primary-T flow cytometry GFP plot; C: CAR-T flow cytometry scatter plot; D: CAR-T flow cytometry GFP plot )

2.2 獲得抗 CD19 CAR 慢病毒

通過融合的 EGFP 報(bào)告分子即可鏡檢初步判斷病毒包裝效率，包裝病毒 72 h 熒光鏡檢并記錄，結(jié)果如圖 1 所示。濃縮的病毒感染 293T 細(xì)胞后，采用實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)，測(cè)定慢病毒滴度，慢病毒滴度達(dá)到 108TU/ml。

2.3 慢病毒介導(dǎo)的 T 細(xì)胞 CAR 表達(dá)效率

在慢病毒感染 T 細(xì)胞過表達(dá) CAR 分子的第3 天，鏡檢感染成功。結(jié)果初步表明融合蛋白能夠在 T 細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)后，在第5 天，感染慢病毒載體的 CAR-T 細(xì)胞與未感染慢病毒的 primary-T 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析表明，融合蛋白表達(dá)效率約達(dá) 50%，結(jié)果如圖 2 所示。

2.4 CAR-T 細(xì)胞受 CD19 陽(yáng)性細(xì)胞特異性激活

圖3 CAR-T 細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)后分泌 IL-2 檢測(cè)（**P＜ 0.01）Figure 3 IL-2 secretion of CAR-T and primary-T assayed by ELISA (**P ＜ 0.01)

圖4 CAR-T 對(duì)靶細(xì)胞殺傷作用的鏡檢圖（A：CAR-T 細(xì)胞 + K562CD19+ 細(xì)胞；B：Primary-T 細(xì)胞 + K562 細(xì)胞；C：CAR-T細(xì)胞 + K562 細(xì)胞；D：K562CD19+ 細(xì)胞）Figure 4 Results for killing effect of CAR-T cells (A: CAR-T + K562CD19+; B: Primary-T + K562; C: CAR-T + K562;D: K562CD19+)

T 細(xì)胞激活后分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫活性，其中 IL-2 分泌量常被用來(lái)評(píng)價(jià) T 細(xì)胞的活化水平。通過 ELISA 分析發(fā)現(xiàn)（圖 3），CAR-T 細(xì)胞僅在與具有 CD19 表面抗原的 K562CD19+細(xì)胞共培養(yǎng)的時(shí)候，才具有分泌大量 IL-2 的能力，其IL-2 分泌量達(dá) 1387.33 pg/ml，顯著高于無(wú)靶細(xì)胞組和 K562 靶細(xì)胞組（**P＜ 0.01），表明 CAR-T 細(xì)胞能夠被 CD19 蛋白分子特異性激活。同時(shí)，CAR-T 細(xì)胞相對(duì)于 primary-T 細(xì)胞，對(duì) K562CD19+細(xì)胞有特異性識(shí)別能力，primary-T 細(xì)胞并不能被K562CD19+細(xì)胞激活。

2.5 CAR-T 細(xì)胞有效殺傷 CD19 陽(yáng)性細(xì)胞

靶向殺傷腫瘤細(xì)胞是 CAR-T 細(xì)胞的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和實(shí)施目標(biāo)。鏡檢結(jié)果表明，同 CAR-T 細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于其他對(duì)照組，個(gè)體較大的靶細(xì)胞K562CD19+的細(xì)胞數(shù)量明顯變少（圖 4）。進(jìn)一步通過 LDH 釋放實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè) CAR-T 細(xì)胞的殺傷能力。圖 5表明，隨著效靶比逐漸升高（效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞依次為 1.25:1、2.5:1、5:1、10:1），細(xì)胞殺傷的細(xì)胞裂解只有 CAR-T 與 K562CD19+細(xì)胞共孵育的一組顯著升高，其余兩組有輕微升高。在效靶比 2.5:1、5:1、10:1 時(shí)，CAR-T 對(duì) K562CD19+的殺傷作用明顯高于兩個(gè)對(duì)照組（P＜ 0.05，圖 5）。鏡檢結(jié)果和 LDH 釋放實(shí)驗(yàn)均表明，CAR-T 細(xì)胞針對(duì) K562CD19+細(xì)胞具有靶向性的殺傷作用，并且在一定范圍內(nèi)殺傷作用隨著效靶比升高而升高。

3 討論

生物技術(shù)，尤其是合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)的生物藥物作為化學(xué)藥物的補(bǔ)充，已經(jīng)開始在臨床方面展示了巨大的活力，并服務(wù)于公眾健康[11]。生物技術(shù)藥物因其本質(zhì)上的生物學(xué)特性而具有更好的特異性，進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)具有高效、低毒的治療特點(diǎn)，例如免疫檢查點(diǎn)阻斷劑 PD-1 抗體和過繼性免疫細(xì)胞 CAR-T。合成生物學(xué)構(gòu)建邏輯門的思路和方法為 CAR-T 的快速進(jìn)化和發(fā)展提供了理論設(shè)計(jì)和實(shí)施基礎(chǔ)[12-13]。針對(duì)耐藥/復(fù)發(fā)急性 B 淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL），免疫細(xì)胞治療在血液學(xué)水平和分子學(xué)水平使患者獲得極大程度的緩解[14]。CAR-T療法作為一種新型細(xì)胞免疫療法在血液腫瘤和實(shí)體瘤方面都取得了重要進(jìn)展[15]，本研究的結(jié)果表明表達(dá)抗 CD19 受體的 T 細(xì)胞可以對(duì) ALL 產(chǎn)生強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用，靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖5 CAR-T細(xì)胞在不同效靶比時(shí)的殺傷效果折線圖Figure 5 Cell lysis at indicated effect: target ratios of CAR-T cells and primary-T cells

CAR-T 細(xì)胞最關(guān)鍵的指標(biāo)之一就是其對(duì)特異性靶細(xì)胞的殺傷效率，在較低的效靶比下取得較高的殺傷效率是 CAR-T 研發(fā)的追求目標(biāo)之一[16]。較高的殺傷率不僅能夠降低慢病毒等高成本的耗用，還可以降低癌癥患者回輸所需的嵌合抗原受體修飾的 T 細(xì)胞個(gè)數(shù)，解決因化療/放療等因素造成的T 淋巴細(xì)胞偏低而體外培養(yǎng)擴(kuò)增較慢的問題。本項(xiàng)目研究中，在效靶比僅為 2.5:1 時(shí)，殺傷效率就可以達(dá)到約 22%。

作為 CAR-T 細(xì)胞關(guān)鍵性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，殺傷效率比較常用的評(píng)價(jià)方法有51Cr 釋放實(shí)驗(yàn)法、LDH釋放實(shí)驗(yàn)法、CCK-8 法和 MTT 活性檢測(cè)。51Cr 釋放實(shí)驗(yàn)法由于放射性污染的問題適用范圍小、安全性差。最常用的替代方法 LDH 釋放實(shí)驗(yàn)法操作要求非常嚴(yán)格，影響因素較多，諸如培養(yǎng)基、pH 值、溫度、底物顯色時(shí)間和加終止劑等，尤其是效應(yīng)細(xì)胞本身即對(duì)顯色環(huán)境產(chǎn)生影響。CCK-8 法和 MTT活性檢測(cè)較為粗放，不能精確反映細(xì)胞殺傷的作用。本課題組正在探究流式細(xì)胞染色分析 CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷效率的評(píng)價(jià)方法，有望對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)。

本研究利用腫瘤過繼性免疫治療策略，探究了特異性靶向 CD19 表型細(xì)胞的 CAR-T 細(xì)胞用于B-ALL 治療的作用。本研究克隆構(gòu)建了能夠自剪的熒光報(bào)告的 CAR 分子，并通過慢病毒感染的方式實(shí)現(xiàn)了其在 T 細(xì)胞中的高效表達(dá)（約 50%）。通過細(xì)胞因子 IL-2 釋放實(shí)驗(yàn)和 LDH 評(píng)價(jià)殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該 CAR-T 對(duì) CD19 表型細(xì)胞的特異識(shí)別和殺傷。結(jié)果表明隨著效靶比的升高，抗 CD19 CAR-T 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率也逐漸提高。本研究結(jié)果為應(yīng)用抗 CD19 CAR-T 細(xì)胞用于過繼性免疫細(xì)胞治療的研究提供了基礎(chǔ)。

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