海洋鏈霉菌IMB3-202產生的吲哚咔唑生物堿

王冕，郝曉萌，李嬌，胡媛媛，關艷，王以光，甘茂羅，肖春玲

吲哚咔唑（indolocarbazole）生物堿是一類具有吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核結構的天然產物，具有良好的抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒和神經保護等生物活性[1-2]。該類化合物作用于拓撲異構酶以及與細胞周期有關的激酶，如酪氨酸蛋白激酶（PTKs）、蛋白激酶 A（PKA）、蛋白激酶 C（PKC）等多個作用靶點，其抗腫瘤活性引起廣泛的關注。自 1977 年第一個吲哚咔唑生物堿——星形孢菌素（staurosporine）發現以來，從多個屬的放線菌、黏細菌、藍細菌以及海洋無脊椎動物中，分離得到 130 多個吲哚咔唑天然產物[2]。多個吲哚咔唑衍生物作為抗腫瘤藥物進入臨床研究[2-3]。2017年 4 月，美國食品藥品管理局批準了第一個吲哚咔唑類藥物——米哚妥林（midostaurin，PKC412）上市，用于治療 FLT3 突變陽性的急性骨髓性白血病[4]，表明該類化合物具有良好的臨床應用開發前景。

在從海洋放線菌篩選新抗生素的過程中，我們對黃海分離的放線菌發酵產物進行抗腫瘤細胞活性篩選[5-8]。為了解菌株的次級代謝潛能，對部分陽性菌株進行了基因組測序。利用 AntiSMASH 4.0對菌株基因組次級代謝基因進行分析，發現海洋鏈霉菌Streptomycessp. IMB3-202 基因組中一條基因簇與吲哚咔唑類化合物的生物合成基因非常相似，提示該菌株具有產生吲哚咔唑的次級代謝潛能。為獲得該類化合物，通過優化發酵條件和系統分離純化，分離得到 4 個吲哚咔唑衍生物，包括星形孢菌素（1）[9-10]、3'-O-去甲基星形孢菌素（2）[11]、holyrine A（3）[12]和 K252c（4）[13]。本文主要介紹菌株的基因組序列分析、分離純化、結構鑒定以及活性評價等結果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 菌株 IMB3-202 分離自中國大連黃海黑石礁海灣（38°49'N，121°34'E）深度約為 40 m的海洋沉積物。通過 16S rRNA 基因（GenBank No. HM467146）序列 Blast 比對分析，該菌株與新霉素鏈霉菌 Streptomyces fradiae（GenBank AB184776）相似度達 98.17%，確定該菌株為鏈霉菌屬放線菌。菌株 IMB3-202 中的星形孢菌素生物合成基因簇部分序列數據提交 GenBank 保存（No.MG489830）。

1.1.2 培養基 斜面培養基（R-ISP4 培養基）：淀粉 10 g、磷酸二氫鉀 1 g、硫酸鎂 1 g、氯化鈉1 g、硫酸銨 2 g、碳酸鈣 2 g、麥麩 30 g、海鹽30 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。發酵培養基 1：酪蛋白胨 5 g、丙三醇 5 ml、酵母浸膏 1 g，ddH2O 至1 L，pH 7.0。發酵培養基 2：蔗糖 40 g、NH4Cl 2 g、Na2SO42 g、K2HPO41 g、MgCl2·6H2O 1 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發酵培養基 3：淀粉 10 g、酵母膏 4 g、蛋白胨 2 g、KBr 10 mg、FeSO4·7H2O 4 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發酵培養基 4：酵母膏 2 g、麥芽糖10 g、葡萄糖 4 g、ddH2O 至 1L，pH 7.0 ～ 7.2。發酵培養基 5：胰蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、甘氨酸0.5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。發酵培養基 6：淀粉 25 g、葡萄糖 5 g、蛋白胨 3 g、牛肉膏 3 g、CaCO32.5 g、FeSO41 mg、MnCl21 mg、ZnSO41 mg、CuSO41 mg、CoCl21 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～7.2。發酵培養基 7：淀粉 10 g、葡萄糖 25 g、棉籽餅粉 10 g、蛋白胨 3 g、KH2PO40.1 g、MgSO40.1 g、NaCl 5 g、CaCO35 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。發酵培養基 8：胰蛋白胨 3 g、酪蛋白 4 g、葡萄糖 5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。

1.1.3 儀器與試劑1H 和13C-NMR 譜用Bruker 600 MHz 核磁共振儀測定（溶劑峰為內標）；LC-MS 分析用安捷倫 LC-MSD-Trap/SL 液相色譜-質譜聯用儀（1200 系列）；化合物 HPLC 制備用島津 LC-20AD 液相色譜儀（SPD-M20A 型紫外檢測器）。Amberlite XAD7HP 大孔樹脂為美國羅門哈斯公司產品；Sephadex LH-20 凝膠為美國 GE Biosciences 公司產品；Cosmosil C-18 色譜柱為日本 Nacalai 公司產品；薄層色譜硅膠購自青島海洋化工廠分廠；人工海鹽購自天津中鹽海洋生物公司。基因組掃描圖測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發酵條件優化與產物分析 將保存的菌株 IMB3-202 孢子懸液涂布于 R-ISP4 培養基，28 ℃ 靜置培養 10 d。將活化的菌株接種到每瓶含100 ml 的發酵培養基 1 ～ 8 的 500 ml 三角瓶中，每種培養基分別采用添加 3% 人工海鹽（1A ～ 8A）和不加海鹽（1B ～ 8B）兩種組成形式。于 28 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養 5 d，獲得發酵培養物。發酵液離心獲得上清液，上清液上 XAD7HP 樹脂柱層析，分別用水和丙酮洗脫。收集丙酮洗脫餾分，減壓蒸餾后得到提取物浸膏，將浸膏溶解于 5 ml甲醇中，10 000 r/min 離心 10 min，取上清液 5 μl進行 LC-MS 分析。色譜柱：Capcell MG II C18，3 μmol/L，3.0 mm × 150 mm；柱溫：30 ℃；流動相：A 相為 5 mmol/L 醋酸銨水溶液，B 相為乙腈；梯度：0 ～ 30 min，10% ～ 90% B。流速：0.5 ml/min；檢測波長：280 nm。

1.2.2 發酵產物的分離純化 將活化的 IMB3-202菌種接種于含 100 ml 7A 培養基的 500 ml 三角瓶中，28 ℃、200 r/min 振搖培養 120 h，獲得發酵培養物，共 25 L。將發酵培養物離心得到菌絲體與上清液兩部分。上清液經 XAD7HP 大孔樹脂柱色譜（5 L），依次用水、50%、100% 丙酮洗脫，收集 50% 和 100% 丙酮洗脫餾分，減壓濃縮得到相應的提取物浸膏；菌絲體經丙酮超聲提取 3 次，合并提取液，減壓濃縮得到菌絲體提取物。活性檢測表明，50%、100% 丙酮洗脫餾分和菌絲體提取物均具有抗菌活性。將上述活性部分合并，得到活性組分浸膏共 32.2 g。將該浸膏上硅膠柱層析（600 g），二氯甲烷-甲醇梯度（100:1、50:1、20:1、9:1、4:1、2:1、0:100，V/V）洗脫，經 TLC 板和活性檢測，合并相似餾分得到 7 個組分（F1～F7）。組分 F3（600 mg）經 Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脫，得到 3 個混合組分（F3-1～ F3-3）。組分 F3-1（200 mg）經 HPLC 制備[25% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動相，流速5 ml/min]純化得到化合物 1（100 mg）。組分 F3-2（50 mg）經 HPLC 半制備[30% 乙腈（含 0.1%甲酸）溶液為流動相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 3（3 mg）。F3-3（26 mg）經 HPLC 半制備[40%乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 4（2 mg）。組分 F4（500 mg）經Sephadex LH-20 柱色譜，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脫得到 4 個混合組分（F4-1～ F4-4），組分 F4-3經 HPLC半制備[23% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液為流動相，流速 5 ml/min]純化得到化合物 2（2 mg）。

1.2.3 抗菌活性測定 活性檢定菌株包括銅綠假單胞菌（ATCC27853）、銅綠假單胞菌11（敏感株）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、摩氏摩根菌（ATCC 25830）、摩氏摩根菌 KL-225（多重耐藥菌）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、金黃色葡萄球菌 R6101（甲氧西林耐藥）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、白色念珠菌（ATCC93025）購自 ATCC 或臨床收集，由本課題組保存。活性跟蹤，以摩氏摩根菌作為檢定菌采用紙片擴散法進行[14]。化合物的最低抑制濃度（MIC）采用文獻[15]報道的 96 孔板微量肉湯稀釋法進行。

1.2.4 細胞毒活性測定 細胞毒活性采用 MTT比色法測定[16]。用胰酶消化對數生長期的細胞，以200 μl/孔、含 4000 個細胞的密度接種到 96 孔板中，置于培養箱中培養。24 h 后按照實驗需要加入不同濃度的藥物，每個濃度設有 3 個平行復孔；藥物作用 48 h 后，每孔加入 20 μl 噻唑藍，置于培養箱中培養，4 h 后，吸出 96 孔板中所有液體，每孔加入 150 μl DMSO 溶液，置于水平搖床振蕩20 ～ 30 min，在酶標儀 570 nm 下測定吸光度值（A）。細胞存活率 =（A加藥組–A空白組）/（A對照組–A空白組）× 100%。根據細胞成活率計算半數抑制濃度。空白組為無細胞的完全培養基，對照組為無藥細胞組。

2 結果

2.1 基因組生物信息學分析

利用 Illumina Hiseq 4000 測序平臺獲得的菌株3-202 基因組掃描圖包含 630 個重疊群（contig），堿基總數為 6.4 Mb。利用 antiSMASH 3.0[17]對菌株 3-202 基因組進行次級代謝生物合成基因分析，提示其基因組中包含 20 個次級代謝基因簇，可能的產物類型有鐵載體、非核糖體肽（NPRS）、萜、氨基糖苷、聚酮（PKS）、吲哚類等。其中位于重疊群 ctg75 中的基因簇clu7，與吲哚咔唑類化合物星形孢菌素（sta，GenBank No. AB088119）[18]、蝴蝶霉素（reb，AB071405）[19]、cladoniamide A（cla，JN165773）[20]、K252a（ink，DQ399653）[21]和reductasporine（red，KP274854）[22]等基因簇高度相似（圖 1）。生物信息學分析表明，基因簇clu7含有 13 個基因，其中orf3-5和orf8分別編碼L-氨基酸氧化酶、色吡咯酸合成酶、細胞色素 P450以及單氧化酶（表 1）。它們分別與來自鏈霉菌TP-A0274 的sta基因簇中的staO（蛋白一致性82%）、staD（蛋白一致性 72%）、staP（蛋白一致性 74%）、staC（蛋白一致性 79%）為同源基因，這些基因編碼蛋白負責吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核結構的合成[23]；基因orf6和orf7分別編碼N-甲基轉移酶和O-甲基轉移酶，與sta中的staMA和staMB為同源基因，分別催化星形孢菌素氨基糖單元（L-ristosamine）的 4'-NH2和 3-OH甲基化反應[24]；orf1編碼細胞色素 P450，orf2 編碼 N-糖基轉移酶，這兩個基因與sta中催化吲哚咔唑母核與糖基偶聯反應的兩個蛋白 StaN 和StaG 具有較高的同源性（85% 和 78%）。此外，clu7中還含有轉運及耐藥等相關基因（orf10、11、13）。從圖 1 所示吲哚咔唑類化合物的基因簇可知，cladoniamide A 基因簇cla中同時含有O-甲基和N-甲基轉移酶基因（claM1 和claM3），但缺少糖基合成及連接相關基因；蝴蝶霉素（reb）和K252a（ink）基因簇中僅含有O-甲基轉移酶基因（rebM和inkM），reductasporine 基因簇（red）中不存在甲基轉移酶基因；只有sta中同時包含母核合成、糖基合成與連接、O-甲基、N-甲基轉移酶等基因。因此，clu7的基因組成與sta相似度最高。根據以上分析，推測菌株 3-202 中clu7的產物可能是星形孢菌素類化合物。

圖1 clu7 與其他吲哚咔唑類化合物生物合成基因簇的比較Figure 1 Comparison of clu7 and indolocarbazole biosynthetic gene clusters

表1 海洋鏈霉菌 IMB3-202 clu7 中各片段的功能預測Table 1 Deduced functions of ORFs in clu7 in Streptomyces sp. IMB 3-202

2.2 發酵產物分析

為獲得基因簇clu7的表達產物，我們采用8 種發酵培養基，分別添加 3% 人工海鹽（1A ～8A）和不加海鹽（1B ～ 8B），對菌株 IMB3-202 進行發酵。利用多重耐藥摩氏摩根菌 KL-225 對發酵產物進行抗陰性菌活性測定，結果顯示 5A、5B、6A、6B 和 7A 發酵液顯示出顯著的抗菌活性（抑菌圈 15 ～ 17 mm）。對 7A 培養基發酵產物進行進一步的 LC-MS 分析（圖 2），部分發酵產物中有一些組分顯示出吲哚咔唑類的特征紫外光譜，質譜顯示出m/z467 [M+H]+的準分子離子，提示代謝產物中含有星形孢菌素類化合物[25]。其中，以 7A發酵液中星形孢菌素類成分含量較高，且產物多樣性較豐富。因此，選用 7A 培養基對菌株進行大量發酵和分離純化。

2.3 結構解析

化合物 1（圖 3）為淺黃色粉末，電噴霧質譜（ESIMS）顯示準分子離子峰m/z467 [M+H]+，結合 NMR 數據推測其分子式為 C28H26N4O3。化合物 1 的紫外（UV）光譜在 244、292、334、354、371 nm 顯示出最大吸收峰；1H-NMR 在低場區顯示出 2 組 1,2-二取代芳香質子信號，1 個糖端基質子；高場區顯示出 2 個連氧或連氮次甲基質子，4 個亞甲基質子以及 3 個甲基質子。13C-NMR 譜顯示出 28 個碳信號，DEPT 譜表明這些碳信號分別為 3 個甲基碳（包括 1 個甲氧基δC60.0 和1 個氮甲基δC32.1），2 個亞甲基碳，11 個次甲基（包括 8 個 sp2雜化碳，3 個連氧或氮取代 sp3雜化碳），12 個季碳（包括 1 個羰基碳，10 個芳香碳和 1 個 sp3雜化碳）。以上數據表明，化合物 1 具有吲哚咔唑類化合物的典型 NMR 數據特征[10]。通過與文獻[9-10]報道的波譜數據比對，確定化合物 1 的結構為星形孢菌素。

圖2 菌株 IMB3-202 在 7A 培養基中的發酵產物 LC-MS 紫外 280 nm 色譜圖（A）和總離子流圖（B）Figure 2 LC-MS profile at 280 nm (A) and MS total ion current (B) of the extracts from Streptomyces sp. IMB3-202 cultured in 7A medium

圖3 化合物 1 ～ 4 的結構Figure 3 The structures of compounds 1 - 4

化合物 2（圖 3）的分子式依據 ESIMS 和NMR 數據確定為 C27H24N4O3。化合物 2 的 NMR數據比化合物 1 少 1 個甲氧基信號。此外，C-3'向高場位移 –9.2 ppm，H-3' 向低場位移 0.55 ppm，提示化合物 2 為 1 的 3'-O-去甲基衍生物，結構確定為 3'-O-去甲基星形孢菌素[11]。化合物 3（圖 3）的分子式確定為 C26H24N4O3，不飽和度為 17，比化合物 1 的不飽和度少 1 個。與化合物 1 比較，化合物 3 的 NMR 數據中缺失了氮甲基與甲氧基的信息，提示化合物 3 為星形孢菌素的 3'-O-去甲基-4'-N-去甲基衍生物。此外，化合物 3 中 C-2' 為次甲基信號（δH4.70，q；δC78.4），并且 C-2' 的化學位移較化合物 2 中向高場位移 –15.5 ppm，說明化合物 3 中 C-2' 與 N-13 之間的 C-N 鍵發生斷裂。通過與文獻[12]數據比較，3 的波譜數據與 holyrine A 一致，因此化合物 3 的結構確定為holyrine A。化合物 4（圖 3）的 MS、NMR 波譜顯示其糖單元部分的信號缺失，其結構確定為星形孢菌素的苷元 K252c[13]。

星形孢菌素（1）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax244、292、334、354、371 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數據見表 2；ESIMSm/z：467[M+H]+，933[2M+H]+。

3'-O-去甲基星形孢菌素（2）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax241、289、334、363 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數據見表 2；ESIMSm/z：453[M+H]+。

Holyrine A（3）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）數據見表 2；ESIMSm/z：441[M+H]+。

K252c（4）：淡黃色粉末狀；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）、13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）數據見表 2；ESIMSm/z：312[M+H]+。

2.4 生物活性

對化合物進行體外抗菌活性評價，結果表明，化合物 1 對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以及白色念珠菌具有較弱的抗菌活性，最低抑菌濃度（MIC）值為 128 μg/ml；對銅綠假單胞菌ATCC27853、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等沒有明顯的抑制活性，MIC 值 〉 256 μg/ml。

體外細胞毒活性結果（表 3）顯示，其中用阿霉素作陽性對照，陰性對照未加化合物。化合物 1和 2 對宮頸癌 HeLa 細胞和結腸癌 HCT116 細胞均具有很強的細胞毒活性，IC50值均在納摩爾水平（0.75 ～ 12.3 nmol/L），對乳腺癌 MCF-7 細胞的抑制活性較低，IC50約為 335 nmol/L。化合物 3對以上三種腫瘤細胞的抑制活性比 1 和 2 低約2 倍，表明 N12-C2' 鍵開環導致活性降低。化合物4 對以上腫瘤細胞的抑制活性比化合物 1 和 2低 25 ～ 2500 倍，表明糖基對吲哚咔唑類化合物的細胞毒活性具有重要的影響。

表2 化合物 1 ～ 4 的 NMR 數據*Table 2 The NMR spcetroscopic data for compounds 1 - 4*

表3 化合物 1 ～ 4 的體外細胞毒活性（IC50，nmol/L）Table 3 In vitro cytotoxic activity of compounds 1 - 4(IC50, nmol/L)

3 討論

本研究通過基因組生物信息學分析，在菌株IMB3-202 基因組中發現一條吲哚咔唑生物合成基因簇，進而通過發酵條件優化，最終從中分離并鑒定了 4 個吲哚咔唑類化合物。本研究結果表明，通過基因組學分析，可以在基因水平上預測產物結構，有助于快速識別特定類型的產物，對于微生物天然產物的發現具有重要的指導意義。

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