兩種過氧化氫蒸汽發生器在生物安全三級實驗室中的應用比較

馮小麗，李明華，韓建保，王洪波，鄭永唐

生物安全實驗室是指通過規范的實驗室設計建造、實驗設備的配置、個人防護裝備的使用，嚴格遵從標準化的工作操作程序和管理程序等，可以保證工作人員、周圍環境和實驗因子安全的實驗室[1-2]。按照防護等級的不同，生物安全實驗室分為1 ～ 4 級；高等級生物安全實驗室包括生物安全防護等級為三級和四級的實驗室[2]。

生物安全實驗室的核心是“安全”，因此采取安全、有效的消毒滅菌措施是實驗室生物安全的重要保障，貫穿整個實驗過程直至實驗結束。目前生物安全實驗室常用的空氣消毒方法主要有紫外線照射、化學消毒劑熏蒸等[3]。因紫外線照射需要直接照射被消毒物體表面或空氣才起作用，而對被遮擋的墻壁表面、地面和工作臺面等則不起作用，所以高等級生物安全實驗室基本采用氣體熏蒸消毒方法[4]。常規用的熏蒸消毒劑，包括甲醛（HCHO）、二氧化氯（ClO2）等因其副作用或損壞性明顯，近年來部分高等級生物安全實驗室開始采用汽化過氧化氫（hydrogen peroxide vapor，HPV）進行消毒滅菌[5-6]。

HPV 作為一種新型氣體消毒滅菌技術，已廣泛應用于生物制藥工廠、醫療衛生、生物實驗室等諸多領域。本文旨在觀察兩種過氧化氫蒸汽發生器（BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2）分別對生物安全三級實驗室的房間及傳遞窗的消毒滅菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備 BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2過氧化氫蒸汽發生器購自英國 Bioquell 公司，其中 BIOQUELL Z-2 型過氧化氫蒸汽發生器系統主要由主設備和控制臺組成，適用于空間的消毒滅菌。滅菌前，將主設備推進待滅菌房間，控制臺放置在輔助區，電纜經待滅菌房間與輔助區之間的消毒專用穿墻孔將主設備與控制臺連接。BIOQUELL L-2 型過氧化氫蒸汽發生器是通過設備上兩根管道分別與待滅菌設備的消毒接口連接，形成一個閉合回路，然后進行消毒滅菌，主要適用于對傳遞窗、高效過濾器箱體等帶有消毒接口的設備進行消毒滅菌。

1.1.2 生物指示劑 嗜熱脂肪芽孢試紙條，含細菌芽孢數 2.8 × 106個/片，為藍色薄玻璃紙封套單條包裝，購自美國 Mesalabs 公司。

圖1 密閉房間內生物指示劑布點圖Figure 1 Layout of biological indicator in the enclosed room

1.1.3 培養基 PM/100 Releast 培養基（含特殊配方的大豆酪蛋白降解物和顏色指示劑，24 h 內可觀察得到結果）購自美國 Mesalabs 公司。

1.1.4 消毒劑 30% 分析純過氧化氫溶液購自天津化學試劑三廠。

1.2 方法

1.2.1 房間滅菌效果驗證

1.2.1.1 房間滅菌條件優化 為了確定最佳的過氧化氫空間分布量，首先選擇在一間 120 m3的密閉實驗室內進行條件優化。①生物指示劑布點：將嗜熱脂肪芽孢試紙條分別放置在房間的各個頂角、底角、生物安全柜操作臺下及高效過濾器下游等比較難滅菌的位置（具體布點詳見圖 1）。②消毒滅菌處理：將 BIOQUELL Z-2 過氧化氫蒸汽發生器主機放置在實驗室中間位置，控制臺放置在輔助區。分別按 5、8、10、15 g/m3的過氧化氫空間分布濃度設定好程序，然后啟動滅菌程序，待一個滅菌程序完成后，立即開啟系統排風。③滅菌效果監測：先用手持式過氧化氫探測儀探測房間內的過氧化氫濃度，待過氧化氫降到 1 ppm 安全濃度以內時，進入房間取出嗜熱脂肪芽孢試紙條接種到Releast 培養基（事先加入 5% 硫代硫酸鈉中和劑）中，將未滅菌的嗜熱脂肪芽孢試紙條接種到同批培養基中作為陽性對照，將未加生物指示劑的同批培養基作為陰性對照，同時置于 57 ℃ 恒溫培養箱中培養 24 h。每組試驗至少重復 3 次。

1.2.1.2 不同體積的房間滅菌效果驗證 分別對體積為 120、28、109、52、65 m3的 5 間密閉實驗室進行滅菌效果驗證，按 1.2.1.1 中確定的過氧化氫空間分布量設定滅菌程序，滅菌過程同上。每個房間至少重復試驗 3 次。

1.2.2 傳遞窗滅菌效果驗證 同房間一樣，首先確定了最佳的過氧化氫用量。本實驗室的傳遞窗體積為 1 m3左右。①生物指示劑布點：在傳遞窗的前后、上下角分別布置 1 個嗜熱脂肪芽孢試紙條（具體布點詳見圖 2）。②消毒滅菌處理：將BIOQUELL L-2 過氧化氫蒸汽發生器上的供給管和回流管分別與傳遞窗側面的 2 個消毒專用接口（進氣口和回流口）連接好。分別按 15、20、25、30 g 的過氧化氫總量設定程序，啟動滅菌程序，待一個滅菌程序完成后，立即開啟排風。③滅菌效果監測同 1.2.1.1。每組試驗至少重復 3 次。

圖2 傳遞窗內生物指示劑布點圖Figure 2 Layout of biological indicator in the pass-through box

2 結果

2.1 房間滅菌條件優化結果

經 3 次重復試驗驗證，當過氧化氫空間分布量為 10 g/m3及以上時可以將放置在受測房間不同位置的嗜熱脂肪芽孢載體完全殺滅（表 1）。

2.2 不同體積房間滅菌驗證結果

用 BIOQUELL Z-2 過氧化氫蒸汽發生器分別對 5 間不同體積的密閉房間進行滅菌驗證，3 次重復試驗結果表明采用 10 g/m3的過氧化氫空間分布量可以將放置在房間內不同位置的嗜熱脂肪芽孢載體完全殺滅（表 2）。

2.3 傳遞窗滅菌驗證結果

用 BIOQUELL L-2 過氧化氫蒸汽發生器對傳遞窗進行滅菌驗證，經 3 次重復試驗，結果表明當過氧化氫用量達到 25 g 及以上時可以將放置在傳遞窗內不同位置的嗜熱脂肪芽孢載體完全殺滅（表 3）。

表1 不同過氧化氫空間分布量對密閉房間的滅菌效果Table 1 The sterilization efficacy of different hydrogen peroxide dosage on the enclosed room

表2 過氧化氫對不同體積密閉房間的滅菌效果Table 2 The sterilization efficacy of hydrogen peroxide on the enclosed rooms with different volume

表3 不同過氧化氫劑量對傳遞窗的滅菌效果Table 3 The sterilization efficacy of different hydrogen peroxide dosage in the pass-through box

3 討論

生物安全三級實驗室是從事高致病性病原微生物研究的場所，在這種場所內操作容易引起病原微生物的暴露性感染，導致感染事故發生。此外，危險物質的不正規操作、實驗室關鍵設施設備的故障及廢棄物的不當處理都可能對環境產生風險[7]。采取有效的消毒滅菌方法是預防生物安全實驗室感染及保障實驗活動順利開展的有效措施。HPV 技術是一種新型氣體消毒技術，自從 20 世紀 80 年代推出以來，已廣泛用于隔離器、空氣過濾器、傳染病病房等生物安全消毒領域[5]。目前市面上的過氧化氫蒸汽發生器多數都由英國 Bioquell和美國 Steris 公司生產[8]。本實驗室引進了英國Bioquell 的 BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2兩種過氧化氫蒸汽發生器分別用于房間和傳遞窗的消毒滅菌。

BIOQUELL 過氧化氫蒸汽發生器的主要原理是通過“閃蒸”的方式將液態過氧化氫轉化為氣態過氧化氫，然后 HPV 被均勻地引入密閉空間，并在消毒空間內表面形成 2 ～ 6 μm 的過氧化氫膜，附著在可能寄居微生物的表面，微生物自身會作為核心被形成的微冷凝所包裹，并迅速被此過程殺滅[9-10]。該消毒過程可在常溫常濕的環境下有效進行，不需要進行除濕等特別的預處理。相較于傳統的消毒過程具有快速、安全、無殘留等特點。此外，HPV 相比其他消毒劑（如二氧化氯、甲醛等）具有廣泛的材料適應性，有研究報道 HPV 對各種金屬材料、建筑物、精密儀器等都沒有影響[11-12]。

國內有關 HPV 在生物安全實驗室的相關應用報道很多[6,13]，本研究結果也證明，當 BIOQUELL Z-2 過氧化氫蒸汽發生器用于房間消毒滅菌時，采用 10 g/m3的過氧化氫空間分布量可以將放置在不同體積密閉房間內不同位置的嗜熱脂肪芽孢載體完全殺滅。當 BIOQUELL L-2 過氧化氫蒸汽發生器用于傳遞窗消毒滅菌時，用 25 g 過氧化氫可以將放置在傳遞窗不同位置的嗜熱脂肪芽孢載體完全殺滅。本實驗室需要消毒滅菌的設備主要包括空間（房間、通風系統等）和關鍵防護設備（傳遞窗、隔離器、高效過濾器箱體等），下一步會繼續用 HPV 對這些設施設備進行消毒驗證。

[1] Wei QH. Biosafety laboratory disinfection and sterilization. Chin J Disinfection, 2015, 32(1):55-58. (in Chinese)魏秋華. 生物安全實驗室消毒與滅菌. 中國消毒學雜志, 2015,32(1):55-58.

[2] Liang HG, Huang C, Ma HX, et al. High-level biosafety laboratory and biosafety. Bull Chin Acad Sci, 2016, 31(4):452-456. (in Chinese)梁慧剛, 黃翠, 馬海霞, 等. 高等級生物安全實驗室與生物安全.中國科學院院刊, 2016, 31(4):452-456.

[3] Tie JF, Wang CD, Chen JL, et al. Observation on sterilization efficacy of hydrogen peroxide vapor in biosafety laboratory. Chin J Disinfection,2012, 29(6):463-465. (in Chinese)帖金鳳, 王長德, 陳金龍, 等. 過氧化氫蒸汽對生物安全實驗室滅菌效果觀察. 中國消毒學雜志, 2012, 29(6):463-465.

[4] Cao GQ, Li XB, Dang Y. Risk assessment of space disinfection modes applied to high-level biosafety laboratories. Heating Ventilating Air Conditioning, 2017, 47(3):51-56. (in Chinese)曹國慶, 李曉斌, 黨宇. 高等級生物安全實驗室空間消毒模式風險評估分析. 暖通空調, 2017, 47(3):51-56.

[5] Zhang WF. Vaporized hydrogen peroxide disinfection technology and its application in biosafety field. Chin J Disinfection, 2017, 34(10):959-962. (in Chinese)張文福. 汽化過氧化氫消毒技術及其在生物安全領域的應用. 中國消毒學雜志, 2017, 34(10):959-962.

[6] Yuan GQ, Chen QZ, Zeng GC, et al. Monitor the efficacy of hydrogen peroxide fumigation sterilization in biosafety laboratory. J Trop Med,2015, 15(2):207-209, 220, 封4. (in Chinese)袁廣卿, 陳瓊珠, 曾谷城, 等. 生物安全實驗室過氧化氫熏蒸消毒滅菌效果的監測. 熱帶醫學雜志, 2015, 15(2):207-209, 220, Cover 4.

[7] Li S, Wang QG, Ding F, et al. Environmental risks of high-level biosafety laboratories and containment countermeasures. Milit Med Sci, 2013, 37(6):416-418. (in Chinese)李颯, 王慶改, 丁峰, 等. 高等級生物安全實驗室環境風險及防范對策建議. 軍事醫學, 2013, 37(6):416-418.

[8] Yu ZY. Vaporized hydrogen peroxide sterilization and applications in animal facilities. Pharm Eng Des, 2012, 33(2):49-53. (in Chinese)郁朝陽. 汽化過氧化氫滅菌技術及其在動物設施消毒中的應用.化工與醫藥工程, 2012, 33(2):49-53.

[9] Unger-Bimczok B, Kottke V, Hertel C, et al. The influence of humidity, hydrogen peroxide concentration, and condensation on the inactivation of Geobacillus stearothermophilus, spores with hydrogen peroxide vapor. J Pharm Innovation, 2008, 3(2):123-133.

[10] Watling D, Ryle C, Parks M, et al. Theoretical analysis of the condensation of hydrogen peroxide gas and water vapour as used in surface decontamination. PDA J Pharm Sci Technol, 2002, 56(6):291-299.

[11] Wang P. Introduction of sterilization technology with vaporized hydrogen peroxide. Pharm Eng Des, 2012, 33(6):46-48. (in Chinese)王朋. 過氧化氫消毒滅菌技術介紹. 化工與醫藥工程, 2012, 33(6):46-48.

[12] U.S. Environmental Protection Agency. Compatibility of material and electronic equipment with hydrogen peroxide and chlorine dioxide fumigation. 2010 (2013-11-12) [2018.03.05]. http://cfpub.epa.gov/si/si_public_record_report.cfm?dirEntryId=231565&fed_org_id=1253&address=nhsrc/&view=desc&sortBy=pubDateYear&showCriter ia=1&count=25&searchall='indoor%20outdoor%20decontamination.

[13] Sun B, Zhao SQ, Li G, et al. Design of the best dosage of vapor hydrogen peroxide in disinfection of biosafety laboratory. Shandong Med J, 2014, 54(46):21-23. (in Chinese)孫蓓, 趙四清, 李綱, 等. 氣化過氧化氫用于生物安全實驗室消毒最佳濃度及劑量探討. 山東醫藥, 2014, 54(46):21-23.