BSL-4實驗室設施和關鍵設備生物防護風險研究

胡凌飛，靳愛軍，張柯，劉波波，杜濤，李勁松，李娜

近年來，高致病性病原微生物引發的烈性傳染病在全球范圍內呈現擴散趨勢，新發突發傳染病的不斷暴發，人類社會公共健康和環境受到嚴重威脅，為保障國內控制傳染病的突發事件應急安全以及提升生物國防實力的重大需求，世界各國開始加緊建設高等級病原微生物實驗室[1-4]。2015 年初我國首個生物安全四級實驗室（BSL-4）在中國科學院武漢病毒所竣工，成為國內首個生物安全防護等級最高的實驗室。

高等級生物安全實驗室風險評估包括很多方面，有病原微生物危害評估、實驗室試驗活動風險評估、設施設備安全風險評估以及人員防護風險評估等。設施設備硬件條件是確保生物安全的基礎，其中，一級防護屏障保護的目標是實驗室工作人員，實現人員與操作對象（即感染性材料）之間的隔離，以消除或減少人員暴露于感染性材料。一級防護屏障包括動物隔離設備、生物安全柜、個人防護裝備等。二級防護屏障保護目標是實驗室的外部環境，防止實驗中使用的感染性材料和實驗活動過程中產生的感染性材料擴散到實驗室外，造成外環境污染，引發傳染性疾病的流行。二級防護屏障包括建筑結構、通風空調系統、消毒滅菌系統等[5-8]。本研究采用粘質沙雷菌和噬菌體 ΦX174 作為高致病性細菌和病毒的替代物，通過替代微生物氣溶膠對 BSL-4 實驗室的設施和關鍵防護設備進行生物防護風險的研究，為高等級生物安全實驗室風險評估提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 實驗用菌株為粘質沙雷菌8039 由本所保藏，大腸桿菌（ATCC13706）和大腸桿菌噬菌體 ΦX174（ATCC13706-B1）購于ATCC 菌種保藏中心。采用普通營養瓊脂培養基（TSA）、普通營養瓊脂半固體培養基和營養肉湯培養基培養。

1.1.2 主要試劑及儀器 生物氣溶膠發生采樣一體機和 Collison 氣溶膠發生器為美國 BGI 公司產品；Andersen 六級空氣微生物采樣器為青島眾瑞智能儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 生物防護效果測試系統 BSL-4 實驗室設施和關鍵設備的生物防護效果測試系統包括生物氣溶膠發生單元、生物氣溶膠采集單元和生物氣溶膠進樣單元，如圖 1 所示。利用此測試系統在運行正常的 BSL-4 實驗室內測試生物安全設施設備是否存在生物安全風險。實驗中氣溶膠發生器為Collison 氣溶膠發生器，高等級生物安全實驗室設施設備的下游生物氣溶膠濃度一般較低，因此下游生物氣溶膠采集單元采用 Andersen 六級采樣器。

圖1 生物防護效果測試系統構成示意圖Figure 1 The schematic diagram of the biological protective test system

圖2 生物氣溶膠發生采樣一體機結構示意圖Figure 2 The structure sketch map of the microbiological aerosol sampling unit

根據高等級生物安全實驗室各種設施和關鍵設備對生物氣溶膠防護的要求，上游既包括生物氣溶膠發生，又有生物氣溶膠采樣，考慮到實驗現場的操作需求，采用了自主研制的生物氣溶膠發生采樣一體機，結構如圖 2 所示。生物氣溶膠發生采樣一體機可將生物氣溶膠的發生與采樣集成為一體，在機體的左右兩側分別設計可以橫向和縱向抽拉的收縮桿，分別支撐生物氣溶膠發生器和采樣器，生物氣溶膠發生器的發生距離和高度可以在一定范圍內調整。通過微控制器控制氣流流量、工作模式、工作時間等，儀器內置藍牙通訊模塊，可以通過遙控器遠距離控制儀器運行，避免了人為干擾和實驗人員的氣溶膠暴露危險。

1.2.2 實驗室設施對微生物氣溶膠防護效果的檢測方法

1.2.2.1 排風高效空氣過濾器 生物氣溶膠發生單元在 BSL-4 實驗室的一個排風高效空氣過濾器單元正下方 62 cm 處發生微生物氣溶膠，發生5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在排風高效空氣過濾器單元下方 40 cm 處采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在排風高效空氣過濾器單元采樣口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率（即排風高效過濾器對微生物氣溶膠的過濾效率）。

1.2.2.2 氣密門 生物氣溶膠發生單元在四級實驗室的一個氣密門門縫正前方發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在氣密門門縫正前方采集本底樣本 20 s。用下游生物氣溶膠采集單元在氣密門另一側的門縫正前方采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣過程中按“開門”按鈕使氣密門氣壓下降，模擬氣溶膠泄漏事故，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率。

1.2.2.3 傳遞窗 生物氣溶膠發生單元分別在壓力為 –70 Pa 的傳遞窗和 –40 Pa 的實驗室里發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元采集生物氣溶膠樣本 5 min，如圖 3A 和圖 3B 所示，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率。

1.2.3 實驗室關鍵設備對微生物氣溶膠防護效果的檢測方法

1.2.3.1 動物飼養隔離器

小動物飼養隔離器檢測：因小動物飼養隔離器較小放不下氣溶膠發生裝置，所以氣溶膠發生單元在小動物飼養隔離器外通往總排風管道的一個排風口發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在此隔離器的同一個排風管的下方排風口采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在小動物飼養隔離器的總排風管道高效過濾器口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率。

中型動物飼養隔離器檢測：生物氣溶膠發生單元在中型動物飼養隔離器的隔離艙內發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在中型動物飼養隔離器的隔離艙內口采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在中型動物飼養隔離器的排風口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率。

圖3 傳遞窗防護效率測試示意圖（A：在 –70 Pa 的傳遞窗里發生氣溶膠；B：在 –40 Pa 的實驗室里發生氣溶膠）Figure 3 The schematic diagram of the transfer window (A: Bioaerosols occur in the –70 Pa transfer window; B: Bioaerosols occur in the –40 Pa laboratory)

1.2.3.2 正壓防護服 在 6 m2的密閉空間內，實驗人員穿上正壓防護服，連接生命支持系統，用生物氣溶膠發生單元在正壓防護服外發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在發生單元前方采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在正壓防護服內采集生物氣溶膠樣本5 min，采樣過程中斷開生命支持系統，模擬正壓防護服無正壓狀態，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率。

1.2.3.3 生物安全柜高效過濾器 在生物安全柜正常運行的情況下，用生物氣溶膠發生單元在生物安全柜內發生微生物氣溶膠，發生 5 min 后用上游生物氣溶膠采集單元在發生單元前方采集本底樣本 20 s，用下游生物氣溶膠采集單元在排風高效空氣過濾器單元采樣口采集生物氣溶膠樣本 5 min，采樣后取出平皿進行培養計數并計算防護效率（即排風高效過濾器對微生物氣溶膠的過濾效率）。

1.2.4 微生物氣溶膠粒徑的測量 將采樣平皿放入恒溫培養箱中培養，計數每個平板上的菌落數（或噬菌斑數），根據各級采樣平板的校正菌落數（噬菌斑數）[9]計算氣溶膠顆粒數量中值直徑。依據 Anderson 六級采樣器每一級捕獲的粒子大小不同（一級 〉 7 μm、二級為 4.8 ～ 7 μm、三級為3.4 ～ 4.7 μm、四級為 2.1 ～ 3.3 μm、五級為 1.1 ～2.0 μm、六級為 0.6 ～ 1.0 μm），把六級采樣器捕獲的粒子作為 6 組大小不同數據，根據偏態分布50% 中值直徑的計算公式進行計算。

數量中值直徑公式：P50= L +（i/f）（50%n – C）。公式中 L 為累計頻數中值的組距下限；i 為累計頻數中值的組距；f 為累計頻數中值的粒子數；50%n為累計頻數中值所在組的累計頻數；C 為累計頻數中值[10]。

1.2.5 微生物氣溶膠防護效果計算方法 粘質沙雷菌采樣平板 30 ℃ 恒溫培養 24 ～ 48 h，大腸桿菌噬菌體 ΦX174 采樣平板倒上層后 37 ℃ 恒溫培養 24 h。Andersen 六級采樣平板按照文獻[2]校正后的菌落數（或噬菌斑數）及采樣流量（28.3 L/min）、采樣時間計算設施和關鍵設備對微生物氣溶膠的防護效率。

⑴上游微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或PFU/m3）的計算：

⑵下游微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或PFU/m3）的計算：

⑶實驗室設施和關鍵設備對微生物氣溶膠的防護效率：P =（1 – At/A0）× 100%

2 結果

2.1 微生物氣溶膠粒子大小

粘質沙雷菌氣溶膠顆粒數量中值直徑平均為2.21 μm，噬菌體 ΦX174 氣溶膠顆粒數量中值直徑平均為 2.18 μm。

2.2 實驗室設施防護效果

本研究所測試的生物安全四級實驗室設施對生物氣溶膠的防護效率基本達到 99.9% 以上，氣密門在模擬意外泄漏操作的情況下依然達到超過99.99% 的防護效率（表 1）。

2.3 實驗室關鍵設備的防護效果

生物安全四級實驗室關鍵設備對生物氣溶膠的防護效率都達到了 99.99% 以上，正壓防護服在模擬生命支持系統斷開，發生意外的情況下也達到超過 99.99% 的防護效率（表 2）。

表1 BSL-4 實驗室設施防護效果測試結果Table 1 Test results of protective effect of facilities in BSL-4 laboratory

表2 BSL-4 實驗室關鍵設備防護效果測試結果Table 2 Test results of protective effect of key equipment in BSL-4 laboratory

3 討論

對生物安全實驗室來說，設施設備等硬件是基礎，是生物安全實驗室建設最重要的一個環節，符合國家和行業標準，具備良好的防護效果是保障實驗室生物安全，確保實驗活動正常開展的前提[8]。生物安全實驗室在施工完成后所有設施和關鍵設備都要經過具備專業檢測資質/資格的第三方檢測機構依據相關國家標準進行現場測試，如高等級生物安全實驗室排風高效過濾器測試法有掃描/全效率撿漏法[1]，圍護結構及氣密門檢測有壓力衰減法[11]、煙霧檢測法，動物隔離設備有內外壓差法等。這些檢測方法一般通過檢測壓力變化或發生無生物活性的物理顆粒氣溶膠進行檢漏測試，但鈉鹽霧、固體粉塵或油性顆粒等物理粒子，與生物氣溶膠粒子理化性質不同。空氣微生物模式細菌粘質沙雷菌是細菌中最小者，常用于檢測濾菌器質量，國外使用的模擬病毒指示微生物噬菌體 MS2 多用于濾材過濾效果評價[12-13]。不同種類的微生物氣溶膠具有不同的粒徑分布特征，其中病毒、支原體和細菌等粒徑主要集中在 2 μm 以下，室內微生物氣溶膠粒徑為 1 ～ 10 μm，粒徑小于 10 μm 的粒子能較長時間飄浮在空氣中，并可被人呼吸系統吸入[12,14]。本研究人工發生的粘質沙雷菌和噬菌體 ΦX174氣溶膠顆粒主要分布于 1.1 ～ 4.7 μm 之間，其數量中值直徑分別為 2.21 μm 和 2.18 μm，位于室內空氣微生物氣溶膠粒子大小范圍內，因此可以真實地模擬致病性生物氣溶膠粒子發生泄漏后正常運行著的實驗室設施設備對其的防護效果，同時也是對物理氣溶膠粒子測試法的進一步驗證。

測試結果表明 BSL-4 實驗室內的設施設備在正常運行的情況下，發生生物氣溶膠泄漏風險的概率很小。實驗室硬件設施固然重要，而如何確保硬件設施科學、有效地安全運行和維護保養更為重要，設施設備的日常運行管理要包括正常操作使用、日常維護保養、定期檢測等[8]。實驗室生物安全風險評估應由多項評估方案共同構成，完善的硬件設施，實驗人員職業培訓加上科學有效的組織管理體系、管理機制和管理制度才能在最大程度上降低安全風險。

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