BSL-3實驗室實驗活動及意外事故對室內環境生物污染的定量分析

靳愛軍，胡凌飛，張柯，杜濤，劉波波，李勁松，李娜

近年來，由于新發再發傳染病如 SARS、甲型H1N1 流感、結核、埃博拉等高致病性空氣傳播傳染病的暴發[1-3]，相關的實驗活動日益頻繁，實驗室安全風險也極大增加。生物安全三級（biosafety level 3，BSL-3）實驗室是為開展與第二類病原微生物相關的實驗而設計建造的，其中氣溶膠的形成與傳播是造成生物污染與人員感染的最主要途徑[4]，對實驗活動與意外事故產生的氣溶膠進行定量研究是實驗室生物污染風險評估的重要內容。本文對BSL-3 實驗室中 6 種實驗活動意外事故產生的氣溶膠進行定量研究，分析造成的生物污染風險，為實驗室實驗活動的風險評估及相應的人員防護措施等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘質沙雷菌（8039）為軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所保藏；大腸埃希菌（ATCC 13706）及其噬菌體 ΦX174（ATCC 13706-B1）購于 ATCC 菌種保藏中心。采用普通營養瓊脂培養基（TSA）、普通營養瓊脂半固體培養基和營養肉湯培養基培養。Andersen 空氣微生物采樣器購自青島眾瑞智能儀器有限公司；0.85% 生理鹽水采樣管購自友康恒業生物科技（北京）有限公司。一次性環氧乙烷滅菌培養皿（直徑 90 mm，傾注普通營養瓊脂培養基）。

1.2 方法

本研究模擬的實驗操作均在正常運行的BSL-3 實驗室的生物安全柜外進行，實驗過程保持溫度 26 ℃，濕度 76%，壓力 –93 Pa。每次實驗操作之前首先使用 Andersen 二級空氣微生物采樣器對環境本底進行采樣，作為空白對照，以確定環境中是否存在替代微生物。

實驗中粘質沙雷菌的濃度為 4.68 × 109CFU/ml和 4.68 × 107CFU/ml，噬菌體 ΦX174 的濃度為1.32 × 108PFU/ml 和 1.32 × 107PFU/ml。表面采樣使用無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水在采樣表面均勻涂抹 5 cm × 5 cm 的方形區域 5 次[5]，將采樣后的拭子放入生理鹽水管中，充分混勻振蕩使采集到的微生物充分釋放。吸取 1 ml 的采樣液直接滴加至平皿中充分混勻，然后對采樣平皿進行培養。每平方厘米的微生物數為 M = N·F·D/A，其中 N 為平皿培養之后的菌落數（或噬菌斑數）；F 為采樣管內液體總體積；D 為稀釋倍數；A 為采樣涂抹面積。每次實驗后噴灑 75% 的酒精溶液和紫外燈徹底消毒滅菌。

1.2.1 吹吸混勻產生氣溶膠 將 1 ml 替代微生物培養液置于 2 ml 離心管中，1 名操作人員使用移液槍反復吹吸混勻，操作 15 min。5 min 時使用Andersen 六級采樣器和沉降平皿分別進行采樣。采樣布置如圖 1A 所示。以實驗過程中移液槍和離心管的位置為圓心擺放 3 個六級采樣器，半徑為0.2 m，采樣時間 10 min。在相同的圓周的上半圓均勻擺放 6 個沉降平皿，沉降 20 min。結束后在操作區表面半徑 0.2 m 的圓內選取三個點進行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養液重復上述操作。

圖1 6 種實驗操作及意外事故產生氣溶膠的采樣示意圖（A：吹吸混勻；B：離心時離心管破裂；C：超聲裂解；D：培養瓶意外跌落；E：凍干粉意外灑落；F：注射攻毒實驗動物時意外噴出）Figure 1 Diagrammatic sketches of aerosols sampling in 6 kinds of experiments and accidents (A: Mix-up; B: Centrifugation with broken tubes; C: Ultrasonic cleavage; D: Accidental fall-off of culture flask; E: Accidental spattering of lyophilized powder; F:Accidental gush of liquid from the syringe)

1.2.2 離心時離心管破裂產生氣溶膠 將 15 ml粘質沙雷菌液裝入 50 ml 離心管中，將離心管塑料蓋中央剪開一直徑 3 mm 的孔，模擬離心時離心管破裂的意外事故，放入離心機中在溫度 4 ℃、轉速12000 r/min 的條件下離心 10 min。采樣布置如圖1B 所示。離心機周圍放置 3 個 Andersen 六級采樣器，離心開始同步進行采樣，離心結束打開保護罩之后繼續采樣 5 min。離心機周圍擺放 6 個沉降平皿，沉降 20 min。氣溶膠采樣結束后在離心機周圍選取 3 個位置進行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養液重復上述操作。

1.2.3 超聲裂解產生氣溶膠 濃度為 4.68 ×109CFU/ml 的粘質沙雷菌液裝在 2 ml 離心管中超聲裂解 5 min。采樣布置如圖 1C 所示。在超聲破碎儀腔室正對位置對稱擺放 2 個 Andersen 六級采樣器和 4 個沉降平皿，超聲裂解的同時開啟進行采樣，Andersen 采樣時間 5 min，沉降 20 min。完成超聲裂解后在操作區臺面選取 3 個位置進行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養液重復上述操作。

1.2.4 培養瓶意外跌落產生氣溶膠 將微生物培養液 30 ml 裝入三角瓶中，從實驗人員手中意外跌落。采樣布置如圖 1D 所示。距離跌落點 1 m 的圓周上均勻擺放 3 個 Andersen 六級采樣器，采樣時間 10 min。四周擺放 13 個沉降平皿，沉降20 min。更換不同濃度的微生物培養液重復上述操作。

1.2.5 凍干粉意外灑落產生氣溶膠 將替代微生物培養液冷凍干燥制成粉末分裝于小三角瓶內，每個裝 0.4 g，從操作者手中掉落到地板上，粉末灑出。采樣布置如圖 1E 所示。距離灑落點 1 m的圓周上均勻放置 3 個六級采樣器，采樣時間5 min。同時在灑落點周圍擺放 13 個沉降平皿，沉降 20 min。更換凍干粉重復上述操作。

1.2.6 注射攻毒實驗動物時意外噴出產生氣溶膠 注射器中吸取 0.2 ml 微生物培養液，模擬攻毒液從注射器中噴出到環境中的意外事故。采樣布置如圖 1F 所示。在距離操作點 0.1 m 處均勻放置3 個 Andersen 六級采樣器，同時開始采樣，采樣時間 5 min。在四周擺放 6 個沉降平皿，沉降20 min。更換不同濃度的微生物培養液重復上述操作。

1.3 替代微生物采樣平皿的培養與氣溶膠濃度的計算

粘質沙雷菌采樣平皿 30 ℃ 恒溫培養 24 h，計數每個平皿的菌落數。噬菌體 ΦX174 采樣平皿倒上層后 37 ℃ 恒溫培養 24 h，計數每個平皿的噬菌斑數。

Andersen 六級采樣器的采樣流量為 28.3 L/min，采樣平皿按照文獻[6]校正后的菌落數（或嗜菌斑數）及采樣流量計算空氣中的微生物氣溶膠濃度。

微生物氣溶膠濃度[7]：C = 5000·N/(A·t)，式中C 為微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或 PFU/m3）；N 為沉降平皿上生長的菌落數（或噬菌斑數）；A 為平皿面積（cm2）；t 為采樣時間（min）。

2 結果

2.1 吹吸混勻產生氣溶膠

吹吸混勻過程產生的氣溶膠濃度見表 1 和表 2，Andersen 采樣器②采集到的微生物氣溶膠濃度最高，說明實驗人員操作過程中，在其正面產生的氣溶膠濃度最高。對操作區表面采樣的結果均為 0。

2.2 離心時離心管破裂產生氣溶膠

離心管破裂條件下進行離心時，產生的氣溶膠濃度見表 3 和表 4，微生物氣溶膠的最高檢測濃度為 16 CFU/m3。對操作區表面采樣的結果均為 0。

2.3 超聲裂解產生氣溶膠

超聲裂解時產生的氣溶膠濃度見表 5，采樣的最高氣溶膠濃度為 92 CFU/m3。對操作區表面采樣的結果為 0。

表1 吹吸混勻產生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結果Table 1 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up-results of the Andersen sampling

表2 吹吸混勻產生氣溶膠濃度-沉降法采樣結果Table 2 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up - results of the settling sampling

表3 離心時離心管破裂產生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結果Table 3 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the Andersen sampling

表4 離心時離心管破裂產生氣溶膠濃度-沉降法采樣結果Table 4 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the settling sampling

表5 超聲裂解產生氣溶膠濃度Table 5 Concentrations of aerosols generated in the process of ultrasonic cleavage

2.4 培養瓶意外跌落產生氣溶膠

培養瓶意外跌落產生的氣溶膠濃度見表 6 和表 7，采樣最高值為 1576 CFU/m3。且 Andersen 與沉降法采樣結果的分布一致。

2.5 凍干粉意外灑落產生氣溶膠

替代微生物凍干粉意外灑落產生的氣溶膠濃度見表 8 和表 9，采樣最高值為 1618 PFU/m3。與 2.4 所示結果相反，噬菌體 ΦX174 凍干粉產生的氣溶膠濃度遠高于粘質沙雷菌凍干粉意外灑落的結果，這可能是凍干粉中微生物含量不一致的影響。

2.6 注射攻毒實驗動物時意外噴出產生氣溶膠

注射時意外噴出至環境中產生的氣溶膠濃度見表 10 和表 11，采樣最高值達 27336 CFU/m3。

表6 培養瓶意外跌落產生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結果Table 6 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the Andersen sampling

表7 培養瓶意外跌落產生氣溶膠濃度-沉降法采樣結果Table 7 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the settling sampling

表8 凍干粉意外灑落產生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結果Table 8 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the Andersen sampling

表9 凍干粉意外灑落產生氣溶膠濃度-沉降法采樣結果Table 9 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the settling sampling

表10 注射攻毒實驗動物時意外噴出產生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結果Table 10 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the Andersen sampling

表11 注射攻毒實驗動物時意外噴出產生氣溶膠濃度-沉降法采樣結果Table 11 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the settling sampling

3 討論

實驗室中的各種實驗活動和意外事故均會產生不同濃度的微生物氣溶膠，根據參考文獻[8-10]，產生的氣溶膠濃度注射攻毒時意外噴出約104CFU/m3，培養瓶意外墜落和凍干粉意外灑落約103CFU/m3（PFU/m3），吹吸混勻、離心時離心管破裂及超聲裂解均為 10 ～ 100 CFU/m3（PFU/m3）。本文在 BSL-3 實驗室中的研究結果與之一致，說明 BSL-3 實驗室中各種實驗活動和意外事故時產生的微生物氣溶膠不能忽視。

不同實驗活動產生不同濃度的微生物氣溶膠，并且產生的氣溶膠粒子大小也不同。據 Kenny 和Sabel[11]的研究，凍干粉意外灑落產生氣溶膠的粒徑大于 5 μm，其他實驗活動的粒徑則小于 5 μm。實驗結果顯示吹吸混勻、離心時離心管破裂及超聲裂解產生的氣溶膠濃度較低，但其粒徑小于 5 μm，會在空氣中長時間懸浮，并且一旦被吸入到達人體肺深部的概率更大，因此對環境的污染及人員感染的風險不可小覷。氣溶膠粒子粒徑越小，其沉降速度越慢，使用沉降平皿采集到的粒子數較 Andersen空氣采樣的結果少，這與本文所述的實驗結果一致。

環境濕度對氣溶膠粒子的影響也很顯著。當環境比較干燥時，氣溶膠粒子攜帶的水分蒸發較快，從而使粒子變小，更易長時間懸浮于空氣中，不易沉降；而當環境濕度較高時，氣溶膠粒子作為凝結核易于吸收更多水分變大甚至發生團聚，從而沉降速度加快。BSL-3 實驗室具有獨立的通風循環系統，微生物氣溶膠會隨著氣流在實驗室內漂浮，實驗人員活動也會影響實驗室內的氣流，降低氣溶膠粒子沉降速度，增加感染的風險。

綜上，在 BSL-3 實驗室內進行實驗活動時，微生物氣溶膠的感染風險需要引起高度重視，做好個人防護，對呼吸道防護裝備的使用應測試面型密合度，以最大程度地降低或消除實驗活動及意外事故引起的人員感染。

[1] Cunha BA, Pherez FM, Strollo S, et al. Severe swine influenza A(H1N1) versus severe human seasonal influenza A (H3N2): clinical comparisons. Heart Lung, 2011, 40(3):257-261.

[2] Bausch DG, Schwarz L. Outbreak of ebola virus disease in Guinea:where ecology meets economy. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(7):e3056.

[3] Onishchenko GG, Kulichenko AN, Riazanova AG, et al. Analysis of outbreak of anthrax in Omsk region in 2010. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2012, (5):33-36.

[4] Tang JW, Li Y, Eames I, et al. Factors involved in the aerosol transmission of infection and control of ventilation in healthcare premises. J Hosp Infect, 2006, 64(2):100-114.

[5] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. GB/T 18204.4-2013 Examination methods for public places—Part 4: Microorganism on a surface of public articles. Beijing: China Standards Press, 2014. (in Chinese)中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T 18204.4-2013 公共場所衛生檢驗方法 第4部分: 公共用品用具微生物. 北京: 中國標準出版社, 2014.

[6] Andersen AA. New sampler for the collection, sizing and enumeration of viable airborne particles. J Bacteriol, 1958, 76(5):471-484.

[7] Che FX, Yu XH. The theory and application of air microbiological inspection. Beijing: Enyclopedia of China Publishing House, 1998:173-174. (in Chinese)車鳳翔, 于璽華. 空氣微生物采樣理論及其技術應用. 北京: 中國大百科全書出版社, 1998:173-174.

[8] Wen ZB, Chen Y, Du Q, et al. Contamination of microbiological aerosol generated by pathogenic microbiological labs. Milit Med Sci,2013, 37(1):1-5. (in Chinese)溫占波, 陳詠, 杜茜, 等. 病原微生物實驗室實驗操作對室內空氣產生微生物污染的研究. 軍事醫學, 2013, 37(1):1-5.

[9] Hu LF, Wen ZB, Li JS, et al. Quantitative analysis of biological contaminants generated by a series of experiments in BSL-2 laboratory. Chin J Disinfect, 2016, 33(10):951-954, 957. (in Chinese)胡凌飛, 溫占波, 李勁松, 等. BSL-2實驗活動對室內環境生物污染的定量分析. 中國消毒學雜志, 2016, 33(10):951-954, 957.

[10] Du Q, Wang HB, Liu KY, et al. Risk quantification of microbiological aerosol generated by experimental operations in pathogenic microbiological labs. Milit Med Sci, 2015, 39(12):926-928, 933. (in Chinese)杜茜, 王洪寶, 劉克洋, 等. 病原微生物實驗室實驗操作產生氣溶膠風險定量研究. 軍事醫學, 2015, 39(12):926-928, 933.

[11] Kenny MT, Sabel FL. Particle size distribution of serratia marcescens aerosols created during common laboratory procedures and simulated laboratory accidents. Appl Microbiol, 1968, 16(8):1146-1150.