miR-142-3p在結直腸癌組織與細胞中的表達及對細胞增殖影響研究*

朱文俠，楊 玲，成 鈞，楊彥玲，韓振奎，韓繼明，黃廣智，王航輝

1.延安大學醫學院 (延安716000)， 2.西安交通大學附屬紅會醫院 (西安 710054)

miR-142-3p在結直腸癌組織與細胞中的表達及對細胞增殖影響研究*

朱文俠1，楊 玲1，成 鈞1，楊彥玲1，韓振奎1，韓繼明1，黃廣智1，王航輝2△

1.延安大學醫學院 (延安716000)， 2.西安交通大學附屬紅會醫院 (西安 710054)

*陜西省教育廳科學研究計劃項目(2013JK0754)

中國博士后科研項目(2016M600804)

陜西省博士后科研項目(2016BSHEDZZ92)

西安市衛生和計劃生育委員會科研項目(J201602023)

西安市紅會醫院科研項目(YJ2014008)

西安市科技局科研項目[2017115FS/YX009(16)]

△通訊作者

目的：觀察微小RNA-142-3p在結直腸癌組織與細胞中的表達，及其對人結直腸癌細胞增殖的影響。方法：通過組織原位雜交的方法，檢測miR142-3p在結直腸癌患者組織中的表達。通過Realtime-PCR檢測結直腸癌細胞系中的miR142-3p表達。構建pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p過表達載體，并轉染結直腸癌細胞Caco2，通過Realtime PCR檢測重組質粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p載體在結直腸癌細胞系的表達情況。通過Western Blot檢測細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達變化。結果：miR142-3p主要定位于細胞的胞漿，在癌組織和癌旁組織中miR142-3p的表達存在差異。miR142-3p結直腸癌細胞系中呈低表達。在結直腸癌細胞系中過表達miR142-3p可下調細胞周期相關蛋白CyclinD1，抑制細胞增殖。結論：miR142-3p抑制結直腸癌Caco2細胞的增殖，下調細胞周期相關蛋白CyclinD1，有望成為結直腸癌診斷和治療的潛在靶點。

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC )是最常見的惡性腫瘤之一。其發病率在惡性腫瘤中居第3位，病死率居第4位，成為危害人類生命健康的重要疾病[1-6]。微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，直接與靶基因mRNA 3'UTR結合，這可能進一步導致靶mRNA的降解或抑制蛋白質翻譯，誘導mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平對靶基因進行調控，一個microRNA可以調節許多靶基因，同時被許多基因調控。通過抑制其轉錄后水平靶基因的表達，已經證明了miRNAs在調節各種細胞過程(如細胞代謝、增殖、分化和細胞凋亡等生物學過程)以及纖維化中起重要作用[7-10]。研究表明miR-142-3p與腫瘤的發生、發展有關。例如，微小RNA-142-3p在腎細胞癌中表達上調，與腎細胞癌細胞遷移，增殖和凋亡有關[11]。MicroRNA-142-3p調控Wnt信號通路并在乳腺癌的發病中扮有重要作用[12-13]。然而，miR-142-3p是否在結直腸癌的發病機制中起重要作用方面的研究較少，本文擬就該就此發病機制進行如下研究。

材料與方法

1 材料與儀器 細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所，胎牛血清(Gibco BRL)，DMEM培養基、RPMI-1640培養基(Hyclone)，轉染試劑lipo-2000(Invitrogen公司)，SYBR Green試劑盒(大連Takara公司)，原位雜交檢測試劑盒(博士德公司)，hsa-miR-142-3p地高辛探針(Exiqon，18043-15)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，定量PCR儀(ABI公司7500)，紫外光密度分析儀(上海復日公司)，分光光度計(Eppendof, Hamburg, Germany)，電泳儀(Bio-Rad公司)。

2 細胞與細胞培養 細胞常規培養在DMEM、RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)或K-SFM培養基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中，于含5% CO2和95% O2混合氣體的37 ℃培養箱里培養；根據細胞生長狀況，每2～3天傳代1次，以保持細胞處于對數生長期； 所有細胞在實驗期間全部進行支原體檢測，結果均為陰性；經臺盼藍染色分析細胞活力，活力均保持在90%以上。

3 組織原位雜交 組織原位雜交操作過程如下：石蠟切片60℃烤片過夜；二甲苯脫蠟至水；去離子水洗3遍；抗原修復。將片子于1%檸檬酸鈉液(pH6.0)中微波熱修復，取出后放置于100℃烤箱15min；去離子水洗3遍；3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性；去離子水洗3遍；胃蛋白酶消化8 min；去離子水洗3遍；梯度酒精脫水，室溫晾干>20 min；加miR142-3p探針12.5nM/張，封口膜封片，42℃水浴過夜>10h；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)42℃洗3次，30 min /次；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)室溫搖床洗3次，15 min /次；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫搖床洗3次，5 min /次；封閉液室溫封閉20 min；生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫搖床洗3次，5 min /次；SABC-POD室溫孵育30 min；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室溫搖床洗3次，5 min /次；DAB顯色，顯微鏡下觀察15～30s(DAB)，充分水洗，終止反應；自來水沖洗，蘇木素復染。經梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4 實時逆轉錄PCR 按照SYBR Green試劑盒說明書 (大連Takara公司) 操作。反應體系見表1～2。每組設三個復孔，通過計算標準差來衡量實驗誤差。反應在專用的96孔板(MicroAmp optical 96-well)中進行，以Optical adhesive covers (Applied Biosystems)封口，在 ABI7500 FAST 儀器上設定兩步法 PCR擴增程序，詳細過程如下：Stage I：95 ℃ 30 sec，循環一次；Stage II： 95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，循環 40 次；Stage III：95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec，95 ℃ 15 sec，循環 40 次。采用ABI 7500 fast儀器附帶的軟件分析數據，計算出熒光信號超過背景熒光強度所對應的閾值，即循環數Ct 值。計算目的基因與內參β-actin的CT值之差(ΔCt)，以此來反映在等量cDNA起始反應的情況下目的基因表達的差異。Real-Time PCR最終的結果以2-ΔΔCt表示，體現出實驗組目的基因的表達相對于內參表達量的變化倍數，使用這一方法可以直接得到目的基因相對于管家基因的定量。

表1 142-3p引物序列表

表2 miR142-3p表達載體引物序列表

5 載體構建 以pSliencer 4.1-CMV-puro為載體，選取BamHⅠ和HindⅢ兩個酶切位點，插入miR142-3p片段。總共選取兩段，一段為174bp(87bp miR142-3p前體序列+上游35堿基+下游52堿基),一段為417bp(87bp miR142-3p前體序列+上游181堿基+下游150堿基)。30l PCR反應體系包括：3l 10×KOD buffer， 1.2l MgSO4，3l dNTP，0.5l 正向引物(10M)，0.5l反向引物(10M)，2l K562DNA 模板，1l KODase，18.8l雙蒸水補足30l。反應程序按照：95 ℃5 min，重復如下循環35次：94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min。最后72 ℃ 10 min(圖1)。

圖1 pSliencer4.1-CMV-puro載體圖譜

6 蛋白印跡 本研究中蛋白印跡實驗(Western blot)的詳細操作步驟如下：用預冷的0.01 M 的PBS緩沖液(pH 7.4)潤洗細胞2次，按照細胞密度加入適量的含DTT 的2×SDS裂解液，徹底裂解細胞，并收集至EP管中，Type17600 Dri-Bath 調節溫度至95℃，95 ℃煮10 min，冰上放置10 min，重復2次，使蛋白徹底變性，再用95 ℃ 煮 10 min后，12 000 rpm，室溫離心 5min，將上清(即總蛋白)移至另一干凈的EP管中。 利用BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白保存在-80℃冰箱備用，以防降解。根據蛋白定量結果，以10孔板，每孔上樣10 μl蛋白樣品為例，配制蛋白上樣體系，不足的體積用2×SDS裂解液補足，同時加入溴酚藍示蹤。根據目的蛋白分子量大小配制8%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離目的蛋白。

上樣完成后，首先用電壓80 V電泳至分離膠時換電壓為120 V，直至溴酚藍示蹤條帶電泳至電泳槽底部，終止電泳。電泳結束后，取出電泳膠，在預冷的轉膜液中進行轉膜，去除積層膠，將含有蛋白質的分離膠安放在Western blot專用三明治式轉膜夾中，安放順序由負極至正極依次為黑板、海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿和白板。轉膜采用濕轉法，恒流 300 mA或恒壓100 V，轉膜時間根據蛋白質分子量設定為 1 h 40 min，將蛋白轉移至NC膜上。轉膜結束后，注意與分離膠接觸的一面朝上，用TBST將PVDF膜漂洗1次，經麗春紅染色評估蛋白電泳、轉膜以及蛋白定量的情況，然后用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min，充分洗滌直至將麗春紅染色洗凈。將PVDF膜孵育在TBST配制的5%的脫脂奶粉中，室溫 1 h，以封閉PVDF膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜孵育在TBST配制的目的蛋白的相應一抗中，室溫 1 至 2 h 或4 ℃ 孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜3 次，室溫，每次10 min，再將PVDF膜孵育在相應的辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫 1 h。TBST漂洗PVDF膜3次，室溫，每次10 min。抗原抗體復合物用Immobilon Western Chemilminescent HRP Substrate試劑進行顯影，在Fluor Chem E掃膜儀器上檢測蛋白表達情況并曝光存圖。

7 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示。正態分布的兩組組間比較采用t檢驗；非正態分布的兩組組間比較采用非參數檢驗；率的比較采用卡方檢驗和確切概率法，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 miR142-3p在結直腸癌組織中表達下調 對20例結直腸癌病人的腫瘤組織樣本和20例癌旁組織通過組織原位雜交的方法，檢測miR142-3p的表達及定位。實驗結果顯示，miR142-3p成熟體主要定位于細胞的胞漿，根據miR142-3p表達的強弱，主要判斷標準是按照原位雜交染色的強度分為三個等級，陰性(-)、弱陽性(+)和強陽性()，在20例癌組織中miR142-3p陽性表達9例(45%)，其中弱陽性表達7例(35%)，強陽性表達2例(10%)；在20例癌旁組織中miR142-3p陽性表達18例(90%)，其中弱陽性表達2例(10%)，強陽性表達16例(80%)，說明在癌組織和癌旁組織中miR142-3p的表達差異具有統計學意義(P值<0.01,圖2)。

A:組織原位雜交檢測hsa-miR142-3p成熟體在各種類型結腸病變的表達情況(正常粘膜上皮、高分化腺癌、低分化腺癌和粘液癌)；B:比較hsa-miR142-3p成熟體在結直腸癌患者癌旁組織和癌組織表達的差異(癌旁組織n=20例，癌組織n=20例);表達強度分別記為陰性(-)、弱陽性(+)和強陽性()，*P<0.01

圖2 結直腸癌組織hsa-miR142-3p的表達

2 miR142-3p結直腸癌細胞系中呈低表達 通過Realtime-PCR檢測結直腸癌細胞系SW1116、Caco2、HCT-116、Lv-174T中的miR142-3p表達含量(K562細胞作為陽性對照)，發現結直腸癌細胞系中miR142-3p的表達量很低(圖3)。

3 結直腸癌細胞系中過表達miR142-3p下調細胞周期相關蛋白，抑制細胞增殖 將miR142-3p的表達載體(417bp)在結直腸癌細胞系Caco2中瞬時過表達，48 h后細胞計數發現過表達外源性miR142-3p的這組細胞與對照組相比增殖速度明顯減慢，說明外源性的miR142-3p能夠明顯抑制結直腸癌細胞Caco2的增殖。同時Western Blot檢測蛋白發現，過表達外源性miR142-3p 48 h后能夠使細胞周期相關蛋白CyclinD1在蛋白水平表達下降(圖4)。

圖3 結直腸癌細胞系中miR142-3p的表達

A:從K562基因組DNA中分別克隆長174bp和417bp的miR142-3p片段，構建到miRNA的表達載體pSilencer4.1-CMV，通過Realtime PCR檢測重組質粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p載體在結直腸癌細胞系SW1116的表達情況；B:在結直腸癌細胞系Caco2中瞬時轉染重組質粒miR142-3p 417，pSilencer4.1-CMV作為陰性對照，48 h后細胞計數評價細胞增殖情況；C:在結直腸癌細胞系Caco2中瞬時轉染miR142-3p表達載體miR142-3p 417片段，pSilencer4.1-CMV作為陰性對照，48 h后通過Western Blot檢測細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達變化

圖4 過表達miR142-3p能夠抑制細胞增殖

討 論

miRNAs在細胞的生長 、分化 、增殖 、發育 、凋亡和代謝等多種過程中發揮著重要作用 ，miRNAs表達的失衡會導致腫瘤的發生，miRNAs 與結直腸癌的發生、發展密切相關[14-21]。

本研究發現在正常結直腸癌旁組織的粘膜中miR142-3p高表達，癌組織中表達減少，并且隨著腫瘤分化程度的降低，miR142-3p的表達也隨之減少。在結直腸癌細胞系中miR142-3p的表達下調。過表達miR142-3p能抑制結直腸癌Caco2細胞的增值。Zhang等[22]將miRNA-143靶向作用于MACC1的3UTR，下調 MACC1表達； 提示 miRNA-143可能直接作用于其靶分子MACC1，抑制癌細胞侵襲。BOL等[23]發現在CRC細胞系和組織樣本中miRNA-152表達下調；恢復CRC細胞中miRNA-152表達后，CRC細胞增殖、遷移和入侵顯著減少； PIK3R3是miRNA-152直接和功能性下游靶目標，PIK3R3表達和miRNA-152表 達呈負相關；下調PIK3R3表達使miRNA-152超表達，抑制腫瘤細胞生長。另有研究表明[24-28]，一部分miRNAs在腫瘤中呈高表達。我們的研究與BOL等的研究獲得了相似的結果，我們推測miR142-3p與miRNA-152等一部分miRNAs在結直腸癌的發生、發展中起負性調控，另外一部分miRNAs起正性調控作用，如何精準調控？有待于進一步研究。

如何特異性地將 miRNA的激活劑及抑制劑引入腫瘤細胞，以及如何利用 miRNA的表達譜為早期結直腸癌提供診斷和治療依據[29-33]，將是我們面臨的挑戰與機遇。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017[J]. Ca Cancer J Clin, 2017,67(1): 7-30.

[2] Torre LA, Sauer AM, Chen MS Jr,etal. Cancer statistics for Asian Americans, Native Hawaiians, and Pacific Islanders, 2016: Converging incidence in males and females[J]. Ca Cancer J Clin,2016,66(3):182-202.

[3] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics,2016[J]. Ca Cancer J Clin, 2016,66(1):7-30.

[4] El-Shami K, Oeffinger KC, Erb NL,etal.American cancer society colorectal cancer survivorship care guidelines[J].Ca Cancer J Clin,2015,65(6):428-455.

[5] Kyu WJ,Young JW,Chang MO,etal.Cancer statistics in Korea:Incidence,mortalcty survival,and prevalence in 2014[J]. Cancer Rancer Treat,2017,49(2): 292-305.

[6] Kuipers EJ, Grady WM, Lieberman D,etal.Colorectal cancer[J]. Nat Rev Dis Primers,2015,1:15065.

[7] Di Leva G, Garofalo M, Croce CM.Micro RNAs in cancer[J].Annu Rev Pathol,2014,9:287-314.

[8] Scott M. Hammond.An overview of microRNAs[J].Adv Drug Deliv Rev,2015,87:3-14.

[9] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism,and function[J]. Cell,2004,116: 281-297.

[10] Wang Y, Ouyang M, Wang Q,etal.MicroRNA-142-3p inhibits hypoxia/reoxygenation induced apoptosis and fibrosis of cardiomyocytes by targeting high mobility group box 1[J]. Int J Mol Med， 2016,38(5): 1377-1386.

[11] Li Y, Chen D, Jin LU,etal.Oncogenic microRNA-142-3p is associated with cellular migration, proliferation and apoptosisin renal cell carcinoma[J].Oncol Lett, 2016,11(2): 1235-1241.

[12] Hu T, Phiwpan K, Guo J,etal. MicroRNA-142-3p negatively regulates canonical Wnt signaling pathway[J].PLoS One, 2016,11(6): e0158432.

[13] Taichi I, Shigeo H, Daniel J H,etal.miR-142 regulates the tumorigenicity of human breast cancer stem cells through the canonical WNT signaling pathway[J].eLife,2014,3: e01977.

[14] 邱 偉,楊成琳,劉 陽.miR-210通過下調JAK-STAT信號通路抑制膽囊癌細胞增殖的實驗研究[J].陜西醫學雜志,2016,45(6):652-655.

[15] Gemma B, Francisco RM, Alex T,etal.Colorectal cancer: From prevention to personalized medicine[J].World J Gastroenterol,2014,20(22):6786-6808.

[16] 段敏丹,陳 雪,王 悅,等.微小RNA多態性和非小細胞肺癌遺傳易感性關系研究[J].陜西醫學雜志,2017,46(7):833-835.

[17] Marco R, Cristina B, Luisa S,etal.Non-coding landscapes of colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2015,21(41):11709-11739.

[18] 關 舒,于鑫淼, 毛曉韻,等. miR-487a 增加MCF-7/MX荷瘤鼠對米托葸醌敏感性機制探 討[J].陜西醫學雜志,2015,44(12):1574-1576.

[19] 彭志平,袁 飛,史學森.MicroRNA家族在結直腸癌發生發展過程中的作用[J].內蒙古醫科大學學報,2013,35(5):403-406.

[20] 米志寬,趙菊梅, 劉勇峰,等.稀釋碘伏對人結腸癌細胞增殖的影響[J].陜西醫學雜志,2013,42(3):268-270.

[21] 魏少忠,胡 勝.結直腸癌的精準醫學：大數據和微進展的時代[J].中華結直腸疾病電子雜志,2016,5(5):370-375.

[22] Yu Z, Zhongqiu W, Min C,etal.MicroRNA-143 targets MACC1 to inhibit cell invasion and migration in colorectal cancer[J].Mol Cancer, 2012,11: 23.

[23] Bo L,Xie Z,Bai L.miR-152 functions as a tumor suppressor in colorectal cancer by targeting PIK3R3[J]．Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine,2016,37(8):10075-10084.

[24] Linwensi Z, Jingyuan F.The structure and clinical roles of MicroRNA in colorectal cancer[J].Gastroenterol Res Pract,2016,2016: 1360348.

[25] Lina C, Peter W, Eide GE.etal.MicroRNAs as growth regulators, their function and biomarker status in colorectal cancer[J].Oncotarget,2016, 7(6): 6476-6505.

[26] Danese E, Minicozzi, AM. Benati M,etal.Reference miRNAs for colorectal cancer: analysis and verification of current data[J].Sci Rep, 2017, 7: 8413.

[27] Laura C, Claudio I, Consalvo P,etal. MicroRNA-mRNA interactions underlying colorectal cancer molecular subtypes[J].Nat Commun, 2015,6: 8878.

[28] Sushmita P, Petra L, Arndt H,etal. Identification of miRNA-mRNA modules in colorectal cancer using rough hypercuboid based supervised clustering[J].Sci Rep,2017,7: 42809.

[29] Jun W, Yong XS, Bin M,etal. Regulatory roles of Non-coding RNAs in colorectal cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(8): 19886-19919.

[30] Jingmei L, Chia CC, Li Z.Potential roles of microRNAs and ROS in colorectal cancer: diagnostic biomarkers and therapeutic targets[J].Oncotarget, 2017, 8(10): 17328-17346.

[31] Gemma B, Francisco R, Alex T,etal.Colorectal cancer: From prevention to personalized medicine[J].World J Gastroenterol,2014,20(22): 6786-6808.

[32] Marco R, Cristina B, Luisa S,etal.Non-coding landscapes of colorectal cancer[J].World J Gastroenterol, 2015,21(41): 11709-11739.

[33] 李 俊.參麥注射液聯合化療對結直腸癌Lovo 細胞的增殖抑制作用[J].陜西中醫,2015,36(5):629-630.

(收稿：2017-09-18)

TheexpressionofmiR-142-3pincolorectalcanceranditseffectonproliferation

Zhu Wenxia，Yang Ling，Cheng Jun,et al.

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Objective: To observe the expression of microRNA-142-3p in colorectal cancer and its effect on the proliferation of human colorectal cancer cells. Methods: The expression of miR142-3p in the tissues of colorectal cancer was detected by in situ hybridization. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime-PCR. Construction of pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p overexpressing vector, the colorectal cancer cells Caco2 was transfected. The expression of recombinant plasmid pSilencer4.1-CMV-miR142-3p vector in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime PCR. The expression of CyclinD1 was detected by Western Blot. Results: miR142-3p was mainly located in the cytoplasm of cells, The expression of miR142-3p was different in cancer tissues and adjacent tissues. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was low. Overexpression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines may down-regulate the expression of cell cycle-associated protein CyclinD1, which inhibit cell proliferation. Conclusion: miR142-3p can inhibits the proliferation of colorectal cancer CAGE2 cells and down-regulation the expression of CyclinD1 and is expected to be a potential target for the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms/physipathology @MicroRNA 142-3p Proliferation

結直腸腫瘤/病理生理學 @微小分子142-3p 增殖

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.003