非小細胞肺癌患者外周血中miRNA-4286表達的臨床意義

張建斌 閔偉偉 李鴻偉 馬志紅 戴利成

中國癌癥統計最新數據顯示，2015年我國預計新發癌癥病例429.2萬，癌癥死亡病例 281.4萬，全球惡性腫瘤相關死因中肺癌占27%，僅中國的病例就占1/3以上[1－2]。低劑量螺旋CT的廣泛應用極大提高了早期肺癌的檢出率，但一定程度上增加了過度輻射暴露的風險[3]。因此，探索外周血指標用以診斷腫瘤成為了研究熱點。有文獻報道，miRNA－4286在非小細胞肺癌（NSCLC）患者組織中異常表達[4]，提示miRNA－4286表達水平可能與NSCLC發生、發展相關。本研究通過實時熒光定量PCR技術檢測NSCLC患者外周血中miRNA－4286表達水平，進一步探討其在NSCLC診斷中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2015年5月行肺癌根治性切除的NSCLC患者31例（觀察組），其中男18 例，女 13 例，年齡 36～81（57.06±10.22）歲；腫瘤部位：左上肺7例（22.6%），左下肺6例（19.4%），右上肺7例（25.8%），右中肺 3例（9.7%），右下肺 7例（22.6%）；腫瘤直徑：（2.43±0.13）cm；病理類型：鱗癌 10 例（32.3%），腺癌 18例（58.1%），其他包括腺鱗癌、大細胞癌及基底細胞癌各1例，共3例（9.7%）。選擇同期肺部良性腫瘤手術患者20例為良性對照組，其中男12例，女 8 例，年齡 45～79（63.1±8.1）歲；腫瘤部位：左上肺 4例（20.0%），左下肺2例（10.0%），右上肺7例（35.0%），右中肺3例（15.0%），右下肺4例（20.0%）；腫瘤直徑：（2.05±0.24）cm。選擇同期健康體檢者21例為陰性對照組，其中男 13 例，女 8 例，年齡 43～80（59.4±9.6）歲。3組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法 分別采集兩組空腹血5ml保存，每份血液樣本重復3次試驗。

1.2.1 主要檢測試劑及儀器 實時熒光定量通用試劑（上海吉瑪制藥技術有限公司）、FTC3000實時熒光定量PCR儀 （上海楓嶺生物技術有限公司）、miRNA－4286引物序列 Has－miR－4286－FO：5′－TCTCCTGCACCCCACTCC－3′、Has－miR－4286－RE：5′－TATGGTTGTTCAC GACTCCTTCAC－3′、內參基因引物序列 Cel－mir－39－FO：5′－CGTCGATCACCGGGTGTAAA－3′、Cel－mir－39－RE：5′－TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC－3′。

1.2.2 檢測方法 3組患者均在入院時采集空腹靜脈血3.5ml，1600r/min離心10min，吸取上清液1.5ml置于離心管中，再次于1600r/min離心10min，吸取上清液350ml，置于離心管中并于－80℃冰箱中保存；觀察組于術后第7天清晨再次抽取空腹靜脈血3.5ml，重復上述步驟。

采用Trizol裂解液裂解組織并提取總RNA，RNA反轉錄合成cDNA，取反轉錄產物進行PCR擴增，反應條件：95℃預變性 3min，40 個循環（95℃，12s；62℃，30s；72℃，30s）。miRNA－4286 相對含量以 ΔCT 及 2－ΔΔCT計算，完成后進行蛋白電泳檢測PCR產物大小及完整性。PCR反應體系見表1。

表1 PCR反應體系

1.2.3 計算方法 miRNA－4286相對表達水平以ΔCT表示，ΔCT=（CT內參基因－CT目標基因），CT 值即循環閾值，指反應體系中熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。手術前后兩組配對資料中miRNA－4286相對表達差異以 2－ΔΔCT表示，2－ΔΔCT＞1 表示目的基因表達上調，2－ΔΔCT＜1表示目的基因表達下調。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA檢測結果 以目標RNA逆轉錄所得cDNA為模板擴增的熔解曲線單一峰，說明引物合格，無非特異擴增；以水為模板擴增的熔解曲線沒有峰或只有引物二聚體的小峰，說明體系沒有污染。詳見圖1。

圖1 目標基因Has-miR-4286熔解曲線及（a）內參基因Cel-mir-39熔解曲線（b）

2.2 PCR產物大小及完整性檢測結果 電泳結果顯示PCR產物大小正確，無雜帶，說明無非特異性擴增；電泳結果的陰性對照顯示沒有目的帶，說明體系沒有污染。詳見圖2。

2.3 觀察組術前及術后1周外周血miRNA－4286表達水平比較 觀察組術后miRNA－4286表達水平為ΔCT=－11.179±1.296，較術前（－15.423±3.631）明顯增加，差異有統計學意義（t=－13.598，P＜0.05）。觀察組手術前后配對分析顯示93.5%的患者術后該基因表達上調（2－ΔΔCT值＞1），6.5%的患者術后該基因表達下調（2－ΔΔCT值＜1）。

2.4 3組外周血miRNA－4286表達水平比較 觀察組術前 ΔCT=－15.423±3.631，低于良性對照組（－9.014±0.995）和陰性對照組（－9.459±1.019），差異均有統計學意義（t=－16.032、－14.021，均P＜0.05）；良性對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義（t=2.455，P＞0.05）。

圖2 Has-miR-4286擴增PCR產物電泳圖（a）及Cel-mir-39擴增PCR產物電泳圖（b）

3 討論

miRNA是一種長度約19～22nt的內源性非編碼RNA（ncRNA），依靠自身序列的特異性，通過抑制翻譯或裂解RNA轉錄的方式來調節靶蛋白表達[5]。外周血中minRNA主要存在于凋亡或壞死細胞的外泌體和凋亡小體中，能保持較高的穩定性，因此對癌癥診斷、預測預后有相當大的潛力[6]。自上世紀90年代以來，發現的miRNA已超過一千種，其中超過半數被證明與特定的腫瘤有密切關系；不同種類的miRNA在不同腫瘤中也扮演著不同角色（癌基因或抑癌基因）[7－8]。

miRNA－4286最早是Goff[9]研究人胚胎干細胞（hESC）早期分化過程時發現的，我們通過前期RNA芯片實驗中篩選出來具有表達差異性的新型miRNA，它定位于人類染色體8p23.1，堿基序列為5′－ACCCCACUCCUGGUACC－3′，目前國內外報道較少。國內有學者通過檢測血清前列腺特異性抗原（PSA）升高患者miRNA－4286的表達情況發現miRNA－4286在前列腺癌中呈高表達,與PSA在前列腺癌中的診斷效能比較，其靈敏度為68.75%，特異度為60．06%[10]。另有學者發現miRNA－4286在食管腺癌患者血清中呈高表達狀態，且與患者生存率密切相關，該差異重點表現在HP陰性的患者中[11]。近幾年，國外多項研究表明，miRNA－4286也與大腸癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的發生、發展關系密切[12－14]。

本研究選取了31例NSCLC患者、20例良性腫瘤患者及21例健康體檢患者，對其外周血中miRNA表達水平分別進行比較，發現觀察組中NSCLC患者術后較術前miRNA－4286表達水平明顯上調，觀察組術前與良性對照組和陰性對照組比較差異也有統計學意義。分析原因為：（1）miRNA－4286在NSCLC發生中發揮著類似抑癌基因的作用；（2）NSCLC患者外周血中可能存在某種抑制性上游物質，發揮負性調節作用以減少miRNA－4286表達。此外，觀察組術后miRNA－4286表達水平較良性對照組及陰性對照組更低，差異有統計學意義，說明NSCLC患者術后目標RNA表達水平并未上升至正常，這可能與肺癌患者存在一定量循環腫瘤細胞有關。miRNA－4286在良性腫瘤組（－9.014±0.995）與陰性對照組（－9.459±1.019）之間差異無統計學意義，結合以上結果，筆者認為目標RNA可能與腫瘤的局部侵襲能力和遠處轉移能力有更強的相關性。

總之，miRNA－4286在NSCLC患者外周血中低表達，而術后患者、良性患者和健康人群則進一步上升，可以推測，目標RNA在NSCLC的發生、發展中可能作為一種抑癌基因來調節細胞的增殖和轉移。然而，miRNA－4286在NSCLC中發揮其抑制作用的分子機制有待進一步研究，而且腫瘤在其發生、發展過程中可能發生miRNA表達譜的改變[15]，miRNA－4286是否也存在這種階段特異性同樣值得深入研究。

[1]Wangqing Chen,Rongshou Zheng,Peter DB,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CACancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer Statistics,2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[3]Harris RP.Starting a new discussion about lung cancerscreening[J].JAMA,2015,313(7):717-718.

[4]李麗琴,許麗敏,李靜,等.肺癌、癌旁組織及正常組織中微小RNA表達譜的檢測[J].中華實驗外科雜志,2015,32(2):409-410.

[5]Pitman S,Cho KH.The Mechanisms of virulence regulation bysmall noncoding RNAs in low GC gram-positive pathogens[J].Int J Mol Sci,2015,16(12):29797-29814.

[6]Schwarzenbaeh H,Nishida N,Calin GA,et al.Clinical relevance of circulating cell-free mieroRNAs in cancer[J].NatRev Clin Oncol,2014,11(3):145-156.

[7]Riedmarm LT,SchwentnerR.miRNA,siRNA,piRNAand argonautes:News in small matters[J].RNA Biol,2010,7(2):133-139.

[8]Chunhua Wang,Huiling Yang.The roles and mechanisms of microRNA in tumor[J].J Mol Diagn Ther,2013,5(2):111-116.

[9]Goff LA,Davila J,Swerdel MR,et al.Ago 2 immunopercipitation identifies predicted micriRNAs in humam embryonic stem cells and neural precursors[J].PLoS one,2009,4(9):e7192.

[10]Lin Zhao,Fubo Wang,Xiaolei Shi,et al.Diagnostic value of microRNA-4286 in prostate cancer[J].Academic Journal of Second Military Medical University,2017,38(5):659-663.

[11]Zhai R,Wei Y,Su L,et al.Whole-miRNome profiling identifies prognosticserum miRNAs in esophagealadenocarcinoma:theinfluence of Helicobacter pylori infection status[J].Carcinogenesis,2015,36(1):87-93.

[12]Pehserl AM,Ress AL,Stanze RS,et al.Comprehensive analysis of miRNome alterations inresponse to sorafenib treatment in colorectal cancer cells[J/OL].Int J Mol Sci,2016,17:e2011.doi:10.3390/ijms17122011．

[13]Komina A,Palkina N,Aksenenko M,Antiproliferative andproapoptotic effects of miR-4286 inhibition in melanomacells[J/OL].PLoS One,2016,11:e0168229.doi:10.1371/journal.pone.0168229.

[14]Sand M,Skrygan M,Sand B,et al.Comparative microarray analysis of microRNA expression profiles in primary cutaneous malignant melanoma, cutaneous malignant melanoma metastases,and benign melanocytic nevi[J].Cell Tissue Res,2013,315(1):85-98.

[15]Malumbres R,Sarosiek KA,Cubedo E,et al.Differentiation stagespecific expression of microRNAs in Blymphocytes and diffuse large Bcell lymphomas[J].Blood,2009,113(16):3754-3764.