實時熒光多重聚合酶鏈反應-高分辨率溶解曲線分析鑒別6種致腹瀉性大腸埃希菌的研究

閆李俠 黃至澄 徐黔寧 楊再興 仲人前

已知重要致腹瀉大腸埃希菌有產腸毒素性大腸埃希菌（ETEC）、致病性大腸埃希菌（EPEC）、產志賀毒素大腸埃希菌（STEC，曾名為腸出血性大腸埃希菌EHEC）、腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）、細胞脫落性大腸埃希菌（或細胞致死膨脹性大腸埃希菌，DAEC）等。對于腹瀉患者的大便培養，國內大多數醫院只作幾種傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、真菌的鑒定和報告，但實際工作中由這幾種細菌引起的腹瀉只占腹瀉患者的極少部分，大部分腹瀉患者的病原學尚不能明確，其中致腹瀉性大腸埃希菌占有非常重要的比例[1-3]。常規應用的細菌培養和鑒定手段難以鑒別多種致腹瀉大腸埃希菌，迫切需要一種快速、靈敏、特異的方法[4-7]。實時熒光定量多重聚合酶鏈反應（PCR）后溶解曲線分析是在同一反應體系內加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核苷酸片段，根據反應產物溶解曲線的峰值、高度、寬度、面積鑒別不同的致病菌。本研究建立了檢驗6種致腹瀉大腸埃希菌多重PCR溶解曲線分析方法，該方法對診斷和鑒別診斷大腸埃希菌所致的腹瀉具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌株 EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、EHEC、DAEC 均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），本研究中所用的其它相關菌株包括普通大腸埃希菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌2a型、福氏志賀菌4型、宋內氏志賀菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、阿伯丁沙門菌、甲副傷寒沙門菌等為本實驗室分離保存菌株。

1.2 試劑和儀器 dNTPs、Taq酶、SYBR Green I、Roche Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀均為羅氏公司產品,批號為20161211；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細菌保存和培養 6種致腹瀉性大腸埃希菌及其它相關菌株加入15%甘油保存于－70℃超低溫冰箱中。培養時將大腸接種于液體LB培養基中，37℃200r/min振蕩培養過夜。

1.3.2 DNA模板制備 取過夜培養菌液400μl加入到1.5ml離心管中，12000r/min離心5min，棄上清液，加入400μl去離子水反復吹打，使沉淀物完全重懸，12000r/min離心5min，棄上清液，加入300μl去離子水吹打混勻，水浴中煮沸10min，迅速放于冰上冷卻1min，13000r/min離心5min，將上清液轉移至另1支離心管中－20℃保存備用。

1.3.3 引物設計 查閱大量國內外研究資料，總結分析致腹瀉大腸桿菌所有毒力基因，在GeneBank中對比其特異性，選擇特異性最高的毒力基因。將TM值作為第一參考因素，在毒力基因序列中尋找特異性片段作為目標基因片段，根據目標基因序列的長度，GC含量，使用最大相鄰法預測其TM值，要求TM值在77～95℃并且各不相同，之后用Primer3設計特異性的引物，所有引物用Sigma Genosys再次修訂。

1.3.4 單重 PCR 分別以 EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、STEC、DAEC為模板，加入相應的單一引物對，使用LightCycler 480熒光定量PCR儀，總體積為25μl，0.5U Taq DNA聚合酶，引物終濃度為0.04～0.56μmol/L。94℃預變性5 min后，按變性98℃ 50s、退火60℃ 30s、延伸72℃ 30s進行25個循環，然后75℃延伸1min，反應完成后每隔0.2℃檢測溶解曲線，根據空白管熒光去掉背景熒光后，使用軟件自動計算曲線峰值。

1.3.5 多重PCR擴增反應及其體系優化 以6種菌株混合DNA為模板，分別在同一管中加入2、3、4、5、6、7、8對引物，參考相關研究中曾使用過的反應體系和反應條件，加入緩沖液、Taq聚合酶、SYBR Green I、dNTP，實時熒光定量PCR，反應完成后使用TM Calling analysis軟件自動分析溶解曲線，初步了解曲線特征，查看有無非特異性擴增及交叉反應，反復優化反應體系，直至可以同時擴增出8種基因片段。（1）Taq酶用量從 0.5～2.0U以 0.5U為梯度遞增，鎂離子（Mg2+）濃度從 1.25×10－3～3.75×10－3mol/L 以 1.25×10－3mol/L 為梯度遞增，致腹瀉大腸埃希菌引物濃度從 0.1×10－6～1.0×10－6mol/L 以 0.2×10－6mol/L 為梯度遞增。（2）循環條件優化，循環條件 1:step1:預變性 94℃，30s；step2:變性 94℃，30s；退火60℃,20s；延伸72℃ 30s；35cycles。循環條件 2:step1: 預變性 94℃，30s；step2: 變性 94℃，30s；退火55℃，20s，延伸 72℃，20s，35cycles。比較退火溫度的不同對擴增效率的影響。

1.3.6 多聯熒光PCR的檢出限測定 將致腹瀉大腸埃希菌增菌液培養8h后分別稀釋為10－4～10－85個濃度梯度，從各濃度取50μl菌液分別涂HE瓊脂平板，各涂3個，同樣取各濃度菌液10μl作為模板，進行實時熒光PCR檢測。統計平板上長出的菌落個數，結合相對應的實時熒光PCR的檢測結果，計算出該檢測方法的檢出限。

1.3.7 多重PCR反應特異性檢測 以非致腹瀉性大腸桿菌，其他常見腸道致病菌包括副溶血弧菌、福氏志賀菌2a型、福氏志賀菌4型、宋內氏志賀菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、阿伯丁沙門菌、甲副傷寒沙門菌等的DNA為模板加入8對種大腸埃希菌特異性引物，其他反應參數參考上述研究結果，分析擴增結果，計算特異性百分比。

2 結果

2.1 毒力基因篩選和引物設計 通過反復多次PCR實驗，最終確定使用表1中8種不同毒力基因作為本研究中的目標基因，并設計8對引物。詳見表1。

2.2 單重PCR溶解曲線分析 最終確定，反應體系為表格2時，反應條件為預變性94℃ 30s、變性94℃ 30s、退火60℃ 20s、延伸72℃ 30s進行35個循環，75℃延伸10min時，PCR溶解曲線效果最佳。針對6種致腹瀉大腸獲得了特異性的溶解曲線，分別見圖1－6。8種特異性基因的PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳再次驗證，見圖7。

表1 毒力基因的片段長度、引物序列、TM值、多重PCR時的引物濃度

表2 單重PCR反應體系（μl）

圖1 EPEC溶解曲線

圖2 STEC溶解曲線

圖3 ETEC溶解曲線

圖4 EIEC溶解曲線

圖5 DAEC溶解曲線

圖6 EAEC溶解曲線

圖7 8種基因的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 多重PCR及體系優化 通過反復大量實驗，成功確定了多重PCR擴增的優化組合。多重PCR后的溶解曲線見圖8。實驗中發現EIEC、DAEC均能擴增出ipaH、daaD這兩種基因片段，因此如果這兩種致腹瀉性大腸同時存在時，溶解曲線無法鑒別。其中5種EPEC、EAEC、ETEC、STEC、EIEC 或 DAEC 致腹瀉性大腸可得到明確鑒別。

圖8 多重PCR反應后的溶解曲線（8種不同特異性基因的溶解曲線從左到右分別為：aggR,st,eaeA,lt,stx1,stx2,ipaH,and daaD；從左到右依次為EAEC,ETEC,EPEC,STEC,EIEC,或DAEC）

2.4 多重PCR特異性檢測 分別以非致腹瀉性大腸桿菌，其他常見腸道致病菌等的DNA為模板，擴增結果均為陰性，特異度為100%。表明所選擇的毒力基因具有很強的特異性。

2.5 多重PCR的檢出限測定 多重熒光PCR的檢出限見表3。由于EAEC接種的菌液量是50μl，10-5倍稀釋后平均長出62個菌落，而研究中使用的菌液是10μl，該10μl的菌液中理論上含細菌數為124個，那么對于EAEC PCR反應的最低理論極限是124cfu/ml。其余5種致腹瀉大腸的檢出限見表3，因此，研究中一次反應檢出陽性細菌可以達到個位細菌數。

表3 多重PCR的檢出限

3 討論

溶解曲線分析鑒別不同致病菌的原理：DNA雙鏈解離時所需要的溫度可以在很大范圍內發生變化，不同的DNA序列，長度不同，GC含量不同就會有不同的TM值。如長度相同而GC含量不同解鏈時TM值就有不同；或者長度相同、GC含量相同而GC密度不同也會有不同的TM值。溶解曲線分析的目的是了解DNA片段的TM值，進而根據TM值的不同鑒定不同的基因型。整個過程由TM Calling analysis軟件自動完成。SYBR Green I與雙鏈DNA緊密結合時在530nm處可發出熒光信號，溶解曲線分析時軟件自動監測SYBR Green I的熒光值，隨著溫度的增高，雙鏈DNA解離為單鏈，SYBR Green I的熒光信號隨之減弱，根據熒光信號的變化，軟件自動計算出DNA的TM值。實驗結束后生成一個溶解曲線圖和一個峰圖。溶解曲線圖中可以看到一條隨溫度升高而熒光信號逐漸降低的下降曲線。峰圖中可以看到在標本的TM值處出現一個峰，根據峰的高度、寬度、面積及所在位置不同很容易鑒別不同的致病菌。

多重PCR在同一個反應體系中存在多對引物，每對引物之間存在著相互競爭和抑制、很可能形成引物二聚體等錯綜復雜的情況[8-9]。同時每對引物由于退火溫度、擴增效率的不同，使得多重PCR反應體系內擴增條件的摸索極為費時、費力，需要通過大量實驗反復調整、優化各種引物的濃度及其他反應參數，才能使各個基因片段得到相似的擴增效率并減少非特異性的擴增。研究在優化反應體系時，通過降低長產物的引物濃度同時增加短產物的引物濃度來增加擴增效率，并對Mg2+濃度等進行不斷的調整，比較擴增的效果，把擴增效率最高時的Mg2+濃度作為反應體系的最佳濃度。在多重PCR反應管中，加入不同濃度的Taq DNA聚合酶，比較不同的Taq酶濃度對擴增效率的影響，確定可獲得清晰曲線的最低Taq DNA聚合酶濃度作為反應體系中使用的酶濃度。單重PCR反應時使用的dNTP濃度一般在200μmol/L左右，由于研究中多重PCR反應同時擴增多個目的片段，需要的dNTP濃度比單重PCR反應要高很多，所以研究中將多重PCR反應中的dNTP濃度增加至350μmol/L。通過反復調整，最終成功構建了8對引物鑒別6種致腹瀉性大腸的多重PCR快速檢測方法。本實驗中我們發現EIEC、DAEC均能擴增出ipaH、daaD這兩種基因片段，所以如果這兩種致腹瀉性大腸同時存在時，溶解曲線無法鑒別，其余5種致腹瀉性大腸可得到明確鑒別，實際工作中由EIEC，DAEC這兩種大腸同時導致腹瀉的概率極低，當然在以后的實驗中還需繼續尋找能鑒別這兩種大腸的特異性基因。相關研究中曾經報道DAEC是EIEC的變種[10]，這些變種預測產生幾乎相同的擴增大小，GC含量百分比幾乎相同，GC含量分別為60%和58%。預測TM值差1℃，實際TM值差為0.73℃，所以在研究中尚不能將DAEC與EIEC作有效的區分，至于這兩種大腸ipaH、daaD基因的突變位點具體在什么位置？有幾個突位點？DAEC與EIEC是否是同種大腸埃希菌的不同株？需進一步研究考證。

本實驗對6種致腹瀉大腸埃希菌進行PCR-HRM分型，共產生8種HRM曲線型，一次反應即鑒別5種不同的致腹瀉性大腸埃希菌在國內尚為首次。HRM分析要求擴增達到平臺期后再進行，想要得到良好的PCR溶解曲線分型結果，必須建立標準的系統的操作規程，并對不同的PCR-HRM研究摸索出適合各自特點的反應參數[11-12]。

研究中建立的方法適用于純菌落致腹瀉性大腸致病基因的篩查。以純大腸桿菌純菌落作為模板可以減少干擾物質對多重PCR體系的影響，提高實驗的穩定性。由于傳統血清凝集實驗方法費時費力，單重PCR又僅能檢測其中一種大腸，分別檢測每種大腸的相關基因，工作效率太低，成本相對較高。研究建立的多重PCR溶解曲線分析檢驗周期為30h，PCR完成后不需要凝膠成像系統、更不需要送專業測序公司測序，節約了大量時間，降低了實驗成本。一次性檢測多種致腹瀉性大腸提高了實驗效率。在腹瀉病與食源性疾病的暴發調查和日常監測中具有廣泛的應用價值[13-14]。

目前，質譜分析技術已經應用于臨床微生物的檢驗，它可以直接從培養物中挑取菌落進行分析鑒定，滿足了臨床上對細菌鑒定微量并且快速的要求。如果能開發PCR-HRM分型技術并應用于臨床標本中微生物的鑒定，將PCR-HRM與質譜鑒定技術結合起來應用，將會大大加快臨床微生物學檢驗的發展[15]。

綜上所述，本研究中建立的一管反應鑒別6種致腹瀉大腸埃希菌的PCR-HRM分型技術是一種簡單、快速、高通量、高靈敏度和低成本的新技術，在SNP和基因突變的檢測中具有廣闊的應用前景，在微生物的分子分型診斷中也將具有重要的地位，有必要進行更深入的研究。

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