ApoE基因多態性與腦電圖慢波的關聯性研究

羅伏鋼 李靜 陳梅芳 遲淑梅 宋明芬

老齡化是當今社會人口發展趨勢，其中癡呆是影響人們晚年生活質量的常見疾病之一[1-2]。目前對癡呆尚缺乏有效的治療措施，早期預測其發生的可能性以及出現的早晚，有利于盡早進行干預與預防[3]。目前普遍認為，癡呆患者在出現臨床表現之前，其腦電圖（electroencephalogram，EEG）已表現出異常，其中特征性改變為慢波出現，具體表現為快波α波和β波活動減少，慢波θ波和δ波頻繁出現，即腦電圖慢波化[3]。但是，個體發生癡呆的可能性以及何時發生是個未知數，頻繁地測定腦電圖來判斷癡呆是否發生，不僅給人們帶來不便以及造成經濟壓力，也加重了現有醫療資源的不足。目前研究表明，ApoE基因多態性影響體內載脂蛋白的功能。根據ApoE基因型對ApoE 112和158位點氨基酸的影響，將ApoE 基因型分為 3 種，即 ε2、ε3 和 ε4。ApoE ε2 由 ε2/ε2 和 ε2/ε3 組成，ApoE ε3 由 ε3/ε3 組成，ApoE ε4 由ε2/ε4、ε3/ε4 和 ε4/ε4 組成[2]。其中 ε4 等位基因可以顯著地升高人體內TC濃度，使之易患動脈粥樣硬化[4]。已有研究表明，ApoE ε4/ε4基因型在阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）、血管性癡呆（vascular dementia，VD）中的比例明顯高于對照組[5-7]。但是ApoE基因多態性與腦電圖慢波之間的關聯性尚缺乏研究。因此，本研究旨在探索ApoE基因多態性是否與癡呆發生前的腦電圖慢波及其出現的年齡相關，從而為預測癡呆的發生，并盡早開始干預與預防提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年1月至12月我院老年癡呆早期干預門診的患者112例（研究組）和周邊社區的健康人群112例（對照組）。兩組間性別、年齡、婚姻、BMI、受教育年限、降壓藥使用人數比較均無統計學差異（均P＞0.05），研究組血清TG和TC濃度均高于對照組（均P＜0.05），詳見表1。研究對象入組時，血壓均控制在正常值或正常高值范圍之內，因部分研究對象通過降壓藥進行血壓控制，所以入組時的血壓值，不能代表其真正的水平，故本研究沒有對血壓值進行比較。本研究通過本院倫理委員會的批準，研究對象本人或家屬同意參加此研究，并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：意識清，年齡、性別不限，無腦梗死及相關用藥史，詳細收集病史、體格檢查、神經系統檢查、精神檢查、顱腦CT檢查均無異常者，進行簡易智能量表（MMSE）評定。MMSE評分＞24分，尚未發生癡呆者，對其進行腦電圖檢查，將腦電圖出現慢波且1周后復測仍存在明確的慢波者納入研究組。同時，在周邊社區收集性別、年齡、生活習慣等匹配的正常健康對照。排除標準：吸煙，飲酒，酒精或藥物依賴，重要臟器嚴重疾病，心血管疾病，傳染病，以及可能引起繼發性腦電圖改變的疾病如顱內占位性病變、腦外傷等。

表1 兩組研究對象一般資料

1.3 資料收集 收集性別、年齡、慢波始發年齡（若此次研究前慢波已經確診，則根據病歷以首次明確慢波出現的時間）、婚姻狀況、職業、學歷、生活習慣（吸煙、飲酒、體育鍛煉情況等）、疾病史（各類急慢性軀體、精神疾病）、是否服用降壓藥物、血清TG、TC濃度等資料。

1.4 腦電圖檢查 兩組對象在體格檢查、神經系統檢查、精神檢查、顱腦CT檢查均無異常后，且MMSE評分＞24分的情況下，進行腦電圖檢查。采用美國EMS型腦電圖儀，按照國際10-20系統，安置頭皮電極，做16 導 導 聯 采 樣（FP1、FP2、F3、F4、C3、C4、P3、P4、O1、O2、F7、F8、T3、T4、T5、T6），接地電極置于 Fpz，雙側耳電極作為參考電極。患者取坐位或臥位，清醒閉目狀態下，記錄10min。每例對象以8s為1個采樣單元，選無偽跡腦波采樣，間斷選取1個采樣單元，與健康對照比較，如α、β波減少，且θ波和δ波增多、頻率變低、波幅下降則判定為腦電圖慢波。次周重復測定，結果一致者判斷為腦電圖慢波。

1.5 ApoE基因多態性測定

1.5.1 DNA提取 腦電圖檢查結束后，采集上述研究對象的K2EDTA抗凝血液約1ml，其中0.5ml用于ApoE基因型測定，另外0.5ml用于備查。采用天根生化科技（北京）有限公司生產的血液基因組提取試劑盒抽提血液DNA。操作步驟如下：取0.5ml K2EDTA抗凝血，加入含蔗糖、Tris-HCl、氯化鎂的裂解液對細胞進行裂解，11500×g離心1min，棄上清液，往白色沉淀中加入20mg/ml蛋白酶 K 20μl以及 10%SDS 200μl，56℃10min 進行蛋白質降解，加200μl無水乙醇沉淀DNA，12000r/min離心后用70%乙醇進行清洗，最后將DNA溶解在TE緩沖液（Tris 10mmol/L、EDTA 2mmol/L）中，-20℃保存待用。離心機為美國Thermo公司生產，型號：fresco17。

1.5.2 ApoE基因多態性測定 PCR擴增儀為美國ABI公司生產，型號：Veriti。引物為生工生物工程（上海）股份有限公司生產。PCR反應分為A、B兩個反應體系，體積均為25μl，包含以下共同組分：50ng基因組DNA，12.5μl 2×GC buffer I（Takara公司），0.8μmol/L 共同引物，序列為 5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′。A 反應體系為擴增半胱氨酸基因的擴增體系，除上述成分外，還包括0.8μmol/L識別158位點半胱氨酸的引物（5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′）和 0.4μmol/L 識別112位點半胱氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3′）。B反應體系為擴增精氨酸基因的擴增體系，除上述共同成分外，還包含0.8μmol/L識別158位點精氨酸的引物（5′-ATGCCGATGATGACCTGCAGAATC-3′）和0.4μmol/L識別112位點精氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3′）。PCR 反應條件為：95℃預變性 4min，96℃變性 45s，66℃退火 45s，72℃延伸45s，循環35次，最后72℃延伸5min。結果判讀：A反應液中如果112位點為半胱氨酸，可得到588bp的條帶；158位點如果為半胱氨酸，可得到451bp的條帶；B反應液中如果112位點為精氨酸，可得到588bp的條帶；如果158位點為精氨酸，可得到451bp的條帶。根據ε2的158和112位點均為半胱氨酸，ε4均為精氨酸，ε3分別為半胱氨酸和精氨酸的規律，可判斷出每例被試對象的ApoE基因型。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以及基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗。研究組中不同基因型間的年齡差異比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ApoE基因型和等位基因分布比較 基因型的組間比較：研究組ε4型顯著高于對照組（χ2=31.86，P=0.000）；研究組 ε2、ε3 型明顯低于與對照組（χ2=5.25、13.03，P=0.02、0.000）。等位基因的組間比較：研究組 ε4頻率明顯高于對照組（χ2＝40.42，P=0.000）；研究組 ε2、ε3 頻率明顯低于對照組（χ2＝9.52、10.96，P=0.002、0.001）。詳見表2。

表2 兩組ApoE基因型和等位基因分布比較[例（%）]

2.2 研究組ApoE基因型與腦電圖慢化年齡的關系研究組ApoE各基因型出現腦電圖慢波化時的年齡：ε2型為（70.69±8.29）歲，ε3 型為（67.73±6.10）歲，ε4 型為（64.07±5.57）歲。與常見基因型 ApoE ε3 比較，ε4 基因型的腦電圖慢波始發年齡明顯減小（P=0.003），而ApoE ε2基因型的腦電圖慢波始發年齡明顯晚于其他兩型（P=0.002和0.000）。

3 討論

ApoE是血漿重要載脂蛋白之一，其在血清TC、TG及磷脂的轉運和代謝中發揮作用，也是中樞神經系統膽固醇、磷脂及脂質運輸的調節劑和突觸發生的促進劑[8]。ApoE有3種常見的等位基因，即ε2、ε3和ε4，這3種等位基因分別編碼3種ApoE蛋白異構體，其區別為112位和158位氨基酸序列的不同，ε2兩位點均為半胱氨酸，ε4兩位點都為精氨酸，ε3兩位點分別為半胱氨酸和精氨酸。ApoE基因產生3種純合子（ε2/2，ε3/3，ε4/4）和 3 種雜合子（ε2/3，ε2/4，ε3/4）共 6 種常見基因型[2]。個體間ApoE功能存在著一些差異，基因多態性是造成其功能差異的主要因素[9]，其中ε4可能造成膽固醇穩態、脂質轉運、Aβ沉積等異常[10]。本研究結果顯示，研究組血清TG濃度和血清TC濃度顯著高于對照組，可能與研究組ε4的頻率明顯升高有關。

那么，血清脂質、TC異常是否與癡呆相關呢？有研究者認為，代謝綜合征可能與認知能力下降顯著相關，被認為是癡呆的危險因子，而脂質、TC異常是代謝綜合征的常見表現[11]。也有作者直接研究ApoE ε4基因型與癡呆的關系，如馬永興等[12]的研究表明，ApoE ε4基因型可能與認知障礙、記憶障礙以及癡呆相關。另外，ApoE ε4基因型與老年人的壽命和認知功能相關，攜帶ApoE ε4等位基因的健康人，更容易患輕度認知障礙（mild cognitive impairment,MCI）[13]，眾所周知，MCI是癡呆形成前的重要前期表現[14]。由此可見，ApoE ε4基因型可能通過降低ApoE膽固醇載體的功能，使體內脂質、膽固醇代謝異常，從而促進癡呆的發生。

腦電圖異常是癡呆的典型表現之一[15]。癡呆患者早在腦功能表現出異常之前，腦電圖已經出現慢波[16]。雖然腦電圖檢查是一種無創傷性、價格低廉而且在一定程度上能反映大腦的電生理變化和功能異常，但是目前尚無一種方法，能判斷腦電圖異常何時發生。本研究結果顯示，腦電圖慢波患者ApoE ε4基因型和等位基因頻率明顯高于對照組，且該基因型出現慢波的平均年齡明顯早于ε2和ε3型。因此筆者認為，ApoE ε4基因型可能與腦電圖慢化相關，攜帶此基因者，應在更早期密切關注腦電圖的變化，有利于早期預測癡呆的發生，并適時進行早期干預，對改善預后、提高患者生活質量有重要的意義。

本研究仍存在不足，首先，研究對象數偏少，有些基因型的例數只有數例，如研究組ε2/ε2基因型只有2例。在以后的研究中，需延長研究時間以收集更多的樣本，進一步確認本研究的發現。其次，研究組有些患者入組之前，其腦電圖已經出現慢波，針對這種情況，本研究根據病歷記載，以首次確診慢波的時間作為慢波始發年齡，但是因就診習慣或檢查間隔的不同，個體間慢波始發年齡尚存在一定的差異性，下一步可設計隊列研究進一步加以證實ApoE ε4對腦電圖慢波始發年齡的影響。總之，ApoE ε4等位基因及基因型在腦電圖慢波患者中頻率明顯升高，并具有使腦電圖慢波發生年輕化的趨勢，提示該基因與腦電圖慢波相關。

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