烏藥提取物對酒精性肝損傷大鼠門靜脈內毒素及小腸組織形態學的干預研究

季夢漂 樓招歡 譚明明 丁慧珍 胡志希 王軍偉

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是常見的肝臟早期損傷形式之一。目前，短期內過量飲酒的現象與酗酒成癮造成的慢性酒精攝入均呈上升趨勢，若不及早防治，約8%～20%可發展為肝硬化。關于酒精誘導肝損傷的輔助因素及介導途徑的連鎖反應研究是ALD的熱點，其中包括腸道內毒素和腸滲漏[1]。本課題組前期研究表明，烏藥可通過減輕炎癥反應[2]、抑制抗氧化損傷[3]等作用直接保護肝組織。因此，本研究以“腸－肝軸”為切入點，進一步探討烏藥不同提取物對ALD大鼠腸道內毒素及組織形態學的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SD大鼠88只，雄性，體重180～220g，購自浙江省實驗動物中心，動物質量合格證號：0016074。烏藥：由浙江省天臺山烏藥生物工程有限公司提供，2013年8月采自浙江省天臺縣三州鄉，經該公司陳方標藥師鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm的干燥塊根。陽性對照組采用思密達[博福－益普生（天津）制藥有限公司]，規格3g×10袋，用蒸餾水配制成濃度為0.09g/ml的混懸液備用。白酒：紅星二鍋頭酒（酒精濃度52%），2.0L/瓶，北京紅星股份有限公司；與雙蒸水按一定體積比例稀釋，乙醇體積分數為50%。儀器：TBA－40FR全自動生化儀（日本東芝醫療系統株式會社）；Powerwave340酶標儀（美國Bio－TEK公司）；LEICA RM2245切片機（德國LEICA公司）；VIP－5－Jr－J2組織全自動脫水機（日本 Sakura公司）；EC360組織自動包埋機（南京美康科技有限公司）；YR－21全自動染色機（湖北亞光醫用電子技術有限公司）；BA410生物顯微鏡、Adavance3.2圖象分析系統（香港Motic公司）；Hitachi－7650透射電鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 烏藥提取物的制備 水提取物制備：取烏藥500g，加入12倍量水100℃回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10倍量水以相同條件提取1h，濾取藥液，合并兩次藥液，減壓回收并適當濃縮，即得烏藥水提取物（WYSTW）。醇提取物制備：取烏藥500g，加入12倍量75%乙醇100℃回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10倍量75%乙醇以相同條件提取1h，濾取藥液，合并2次藥液，減壓回收乙醇并適當濃縮，即得烏藥醇提取物（WYCTW）。醇提取物各萃取物：取WYCTW適量依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇分次萃取至色淡，分取并合并各萃取層，減壓回收溶劑，分別得烏藥醇提取物石油醚萃取物（WYCTC1）、烏藥醇提取物乙酸乙酯萃取物（WYCTC2）、烏藥醇提取物正丁醇萃取物（WYCTC3）。取WYCTW各萃取物，用適量吐溫80研磨后，加水置磁力攪拌器混勻，加蒸餾水稀釋，使每毫升藥液相當于1g生藥，即得各萃取物溶液。上述各溶液，臨用前用適量蒸餾水稀釋，使每毫升藥液相當于0.4g生藥。

1.3 動物分組與造模 選取健康雄性SD大鼠88只隨機分為8組，每組11只，即正常對照組、模型對照組、陽性對照組（思密達 0.9g/kg）、WYSTW（4g/kg）組、WYCTW（4g/kg）組 、WYCTC1（4g/kg）組 、WYCTC2（4g/kg）組 、WYCTC3（4g/kg）組，所有大鼠均給予基礎飼料，自由采食飲水。除正常對照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組大鼠均給予乙醇體積分數50%的白酒灌胃造模，1次/d，灌胃容積1.2ml/100g，連續33d造模結束。自造模第1天起，除正常對照組和模型對照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別給予相應的藥物灌胃，1次/d，灌胃容積為1ml/100g（即相當于每100g體重灌入0.4g生藥），連續 33d。

1.4 觀察指標 （1）門靜脈血內毒素（ET）、TNF－α檢測：所有大鼠末次給藥后禁食12h，一次性灌胃給予10mg/kg脂多糖（LPS，美國Sigma公司），3.5h后處死大鼠分別于肝門靜脈和腹主動脈取血，離心制備血清，采用酶聯免疫法測定血清中ET、TNF－α含量（試劑批號20140801A，上海源葉生物科技有限公司）。（2）組織病理學檢查：取回盲部上方15 cm處小腸相同部位，用10% 中性甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精－伊紅（HE）染色后于光學顯微鏡（×100）下觀察腸道組織病理學改變。（3）腸黏膜電鏡觀察：透射電鏡下觀察末段回腸黏膜上皮通透性。

1.5 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD－t法，方差不齊時采用Tamhane’s T2法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 烏藥不同提取物對ALD模型大鼠門靜脈血ET、TNF－α含量的影響 與正常對照組相比，模型對照組大鼠門靜脈血ET、TNF－α含量明顯升高（P＜0.01）。與模型對照組相比，各給藥組大鼠上述指標含量明顯降低（P＜0.05或0.01）。與陽性對照組相比，WYSTW降低指標程度與其相當，而WYCTW降低程度更明顯（P＜0.01）。WYCTW的3個萃取物中，又以WYCTC1和WYCTC3效果較優。見表1。

表1 烏藥不同提取物對ALD模型大鼠門靜脈血ET、TNF-α含量的影響

2.2 對ALD模型大鼠小腸組織形態學的影響 光鏡下可見正常對照組大鼠小腸黏膜上皮細胞形態及結構基本正常，微絨毛整齊、密集，無缺損；模型對照組大鼠小腸黏膜呈部分腸上皮細胞變性、壞死、脫落，間質輕度水腫，少量炎細胞浸潤，絨毛橫徑增寬。與模型對照組相比，陽性對照組及烏藥各給藥組大鼠小腸組織病理變化程度明顯減輕。見圖1（插頁）。

2.3 對ALD模型大鼠小腸黏膜微結構的影響 透射電鏡下可見正常對照組大鼠小腸上皮細胞微絨毛排列整齊、緊密連接，線粒體無明顯損傷（圖2a）；模型對照組大鼠小腸上皮可見不規則、稀疏的微絨毛及腫脹、空泡變性的線粒體（圖2b）；與模型對照組相比，陽性對照組（圖 2c）與烏藥各給藥組（圖 2d、e、f、g、h）大鼠小腸黏膜呈緊密連接的簇狀微絨毛明顯增多，同時線粒體形態較之正常，結構完整。見圖2（插頁）。

3 討論

《諸病源候論》云：“酒者，水谷之精也。其氣焊而有大毒，入于肝膽……。”酒為濕熱二性，多飲則蘊積化毒，戕伐臟腑。長期大量酒精攝入引發氧化應激和脂質過氧化使肝細胞遭遇初次打擊形成脂肪肝，而腸黏膜受損，由內毒素介導的低水平腸源性內毒素血癥，又刺激肝臟發生炎癥、壞死和纖維化形成“二次打擊”[4]。肝臟對來自體內外的非營養性物質如藥物、毒物、代謝產物具有生物轉化作用，這一生理特性也決定了肝臟是最易受侵害和需自我保護的組織，因此以往抗氧化、抗炎、降脂、保護肝細胞的單一治療模式已不適用。

烏藥為理氣藥，具有行氣止痛，溫腎散寒之效。以往作為經典方劑的重要組成，在中醫歷史上為支氣管哮喘、肺氣腫、胃腸紊亂、痛經、疝氣、睪丸炎等眾多患者解除病痛。藥理學研究也顯示烏藥對免疫系統、消化系統、心血管系統、中樞神經系統以及抗病毒等方面均具有廣泛的藥理活性[5]。中藥多靶點、多環節、多途徑整合調節的治療模式有著西藥不可比擬的優勢，為全面探究烏藥治療ALD的作用機制，本研究提取烏藥有效成分進行干預，以期為開發治療酒精肝的藥物奠定實驗基礎。

本實驗采用門靜脈血ET、TNF-α含量作為反映肝損傷的重要指標。眾所周知，酒精作為肝臟毒劑，可削弱正常肝細胞的代謝及結構穩定，損傷線粒體功能，同時又可致小腸黏膜通透性增加，屏障功能減弱，細菌過度滋生，釋放大量內毒素[6]，最終導致腸源性內毒素滲漏，加重肝損傷。內毒素是腸道革蘭陰性菌細胞壁裂解后釋放出的脂多糖，其可通過刺激庫普弗細胞激活誘導TNF-α的產生[7]，本實驗也發現大鼠血清TNF-α與門靜脈血ET含量呈正相關。現已有大量研究闡明“酒精-內毒素-庫普弗細胞-TNF-α等細胞因子-肝臟炎癥”這一損傷途徑和機制[8]。在本實驗中，模型對照組門靜脈血ET、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01），烏藥各給藥組卻對上述指標變化呈現明顯的抑制效應，表明烏藥提取物抗大鼠ALD作用機制與抑制內毒素——TNF-α通路有關。進一步從病理學角度探究，光鏡下，模型對照組小腸黏膜呈部分腸上皮細胞變性、壞死、脫落，間質輕度水腫，各給藥組大鼠小腸組織病理變化程度明顯減輕；電鏡下，各給藥組小腸上皮呈緊密連接的簇狀微絨毛較模型組明顯增多，線粒體形態較之正常，說明烏藥提取物抑制內毒素及炎癥因子的作用可能是通過保護腸黏膜微絨毛，修復上皮緊密連接結構缺損，改善腸道屏障功能，降低腸道通透性實現的。

藥效作用對比，發現WYCTW在調節門靜脈血內毒素和炎癥因子上的作用優于WYSTW及陽性藥物；醇提取物3個萃取物中，WYCTC1和WYCTC3效果較優。已知烏藥中化學成分主要有揮發油、異喹啉生物堿類及呋喃倍半萜三大類[9]。其中，異喹啉生物堿類組分為水溶性，易用水提法得到；呋喃倍半萜組分為脂溶性，醇提部位濃度較高[10]。雖然目前無法得知烏藥作用的具體有效成分及藥效部位，但可大膽推測呋喃倍半萜組分可能是烏藥護肝的主要成分。

綜上所述，烏藥不同提取物抗大鼠ALD的作用機制與抑制內毒素——TNF-α通路有關，具體可能是通過改善酒精引起的腸黏膜損傷、減輕腸源性內毒素血癥來實現的。其主要起效成分可能為呋喃倍半萜組分，而科學提取和使用烏藥護肝活性成分仍有待更深入的研究。

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