頸動脈粥樣硬化患者外周血Th17、Treg比例及阿托伐他汀對其的影響

鐘文津，楊炳昂，景香香，張潔，方小麗，王丹丹，劉麗莉，王可環

(海南省人民醫院，海口570311)

越來越多的研究顯示在動脈粥樣硬化發生、發展過程中存在急慢性炎癥反應，炎癥細胞和炎癥因子的過度活化與動脈粥樣硬化進展和斑塊破裂密切相關[1]。研究發現，輔助性T淋巴細胞17(Th17)/調節性T細胞(Treg)失衡是造成動脈粥樣硬化進展的重要原因[2,3]。阿托伐他汀是治療動脈粥樣硬化的主要藥物，效果明確，但其對Th17、Treg的影響研究較少。本研究觀察了頸動脈粥樣硬化患者外周血Th17、Treg比例變化，探討阿托伐他汀干預對Th17、Treg的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2016年2月～2017年1月我院收治的頸動脈粥樣硬化患者80例，男44例、女36例，年齡39～75(57.6 ± 8.1)歲，合并高血壓39例、糖尿病29例、高脂血癥28例，頸動脈內中膜厚度(IMT)1.3～4.1(2.4±1.1)mm。納入標準：行頸動脈超聲檢查證實存在斑塊，性質為軟斑塊(超聲呈均質或不規則低回聲)；IMT>1.2 mm。排除標準：既往有腦梗死、腦出血、急性心肌梗死、不穩定型心絞痛或血管畸形；近4周內服用非甾體抗炎藥、激素、免疫抑制劑或他汀類藥物；合并嚴重的心肝腎功能障礙、免疫系統疾病、風濕性疾病或腫瘤；合并感染性疾病或發熱；妊娠及哺乳期婦女；不能配合檢查者。將患者隨機分為阿托伐他汀組和常規治療組，每組40例。另選同期體檢健康者40例作為健康組，其中男20例、女20例，年齡37～75(56.1±9.0)歲。三組年齡、性別均具有可比性。

1.2治療方法阿托伐他汀組和常規治療組均積極控制基礎疾病，給予降壓、控制血糖等常規治療。在此基礎上阿托伐他汀組口服阿托伐他汀鈣片40 mg/d。兩組均連續治療3個月。

1.3外周血Th17、Treg檢測阿托伐他汀組及常規治療組分別于治療前及治療3個月結束時，健康組于體檢時，分別采集空腹靜脈血，制備單淋巴細胞懸液，采用流式細胞儀(FACS Aria Ⅲ 型，美國BD公司)檢測Th17、Treg，計算Treg/Th17。

1.3.1單淋巴細胞懸液制備取一支15 mL離心管，加入5 mL Ficoll淋巴細胞分離液，吸取5 mL血液標本置于分離液中，500 g離心30 min；吸取第二層的環狀乳白色淋巴細胞層，加入到另一15 mL離心管中，加入10 mL PBS緩沖液重懸細胞，混勻后250 g離心10 min，棄上清，加入5 mL PBS緩沖液重懸細胞，250 g離心10 min，棄上清，加入5 mL PBS緩沖液洗滌細胞；將細胞重懸于含有10%二甲基亞砜(DMSO)的FBS中，-80 ℃冰箱內過夜，液氮保存。

1.3.2Th17檢測解凍上述淋巴細胞，調整細胞密度為2.0×106個/mL，取200 μL單細胞懸液接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h；收集細胞，等分為測定管和對照管，各加入20 μL FITC-CD4抗體，避光4 ℃孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光4 ℃孵育45 min；測定管中加入20 μL PE標記的IL-17抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；采用流式細胞儀檢測Th17，計算比例。

1.3.3Treg檢測取200 μL單細胞懸液分別加入到測定管和對照管中，再分別加入20 μL FITC-CD4抗體，測定管中加入5 μL APC-CD25抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光4 ℃孵育45 min；測定管中加入20 μL PE-Foxp3抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；采用流式細胞儀檢測Treg，計算比例。

1.4血漿維甲酸受體相關的孤兒受體(ROR-γt)、叉頭翼螺旋轉錄因子(Foxp3)mRNA表達檢測采用RT-PCR法。取各組血液樣本，采用TRIzol法提取總RNA；合成第一鏈cDNA；構建熒光定量PCR反應體系。反應條件為95 ℃ 2 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 55 s(40個循環)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算ROR-γt、Foxp3 mRNA相對表達量。ROR-γt上游引物：CCTGGGCTCCTCGCCTGACC，下游引物：TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC。Foxp3上游引物：CTGGCAAATGGTGTCTGCAAGT，下游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA。

1.5血清IL-17、轉化生長因子β(TGF-β)檢測取1.4中采集的外周血液樣本，離心后取血清，采用ELISA法檢測IL-17、TGF-β。具體步驟參照試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)說明書。

2　結果

2.1三組外周血Th17、Treg比例及Treg/Th17比較見表1。

表1　　　　三組外周血Th17、Treg比例及Treg/Th17比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規治療組同時間點比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

2.2三組血漿ROR-γt、Foxp3 mRNA表達比較見表2。

表2　　　　三組血漿ROR-γt、Foxp3 mRNA相對表達量比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規治療組同時間點比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

2.3三組血清IL-17、TGF-β水平比較見表3。

表3　三組血清IL-17、TGF-β水平比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規治療組同時間點比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

3　討論

Th17和Treg是一組起源相同、分化差異的T細胞亞群，具有互相調節、互相抑制的作用，是除Th1/Th2外的另一組免疫調控細胞。Th17屬于效應性T細胞，通過分泌IL-17、TNF-α等炎癥因子，促進病理性免疫反應的激活。Treg具有免疫無能和免疫抑制兩大特性，能夠抑制免疫細胞增殖和免疫活性，抑制炎癥反應。研究證實，Th17/Treg失衡在炎癥性腸病、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡及部分腫瘤的發生過程中發揮重要作用[4～6]。Gao等[7]研究顯示，ApoE-/-小鼠體內Th17比例升高，轉錄因子ROR-γt和效應分子IL-17表達量也升高，證實Th17比例增加促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。臨床研究發現，急性冠脈綜合征患者外周血中Th17比例及IL-17表達量增高，說明Th17細胞數量增加與斑塊不穩定性相關[8]。

Treg是一種負向調控免疫細胞，具有抑制炎癥反應、保持免疫耐受、維持免疫狀態平衡等效應，其表達量降低可導致機體免疫穩態遭到破壞，出現炎癥反應激活。Treg主要分泌TGF-β和IL-10，抑制和下調IL-6、單核細胞趨化蛋白、細胞間黏附分子等炎癥因子表達，減少炎性細胞積聚，延緩動脈粥樣硬化形成[9]。Treg還可加快低密度脂蛋白和乳糜微粒的分解，下調膽固醇水平，減輕高血脂對巨噬細胞的刺激，抑制內皮細胞活化和斑塊內泡沫細胞增殖[10]。Li等[11]研究顯示，外周血Treg比例下降及Th17/Treg失衡是動脈粥樣硬化斑塊破裂的危險因素。賈寧等[12]研究證實，外周血Treg數量可以反映動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。

本研究80例頸動脈粥樣硬化患者頸動脈斑塊均為軟斑塊，與健康組相比，患者外周血Th17比例升高，Treg比例下降，Th17/Treg失衡；對其下游的效應分子進行檢測發現，Th17分泌的ROR-γt、IL-17 mRNA表達量升高，Treg分泌的Foxp3、TGF-β mRNA表達量降低。提示頸動脈軟斑患者體內存在Th17、Treg失衡。

他汀類藥物是治療動脈粥樣硬化的常規藥物，但其對Th17、Treg數量影響的研究較少。有研究顯示，給予ApoE-/-小鼠辛伐他汀處理后，斑塊內Treg數量增加，Foxp3、IL-10和TGF-β mRNA及蛋白表達均增加，血液IL-17水平降低[13]。王治校等[14]研究認為，阿托伐他汀能夠增加急性冠脈綜合征患者外周血Treg比例并增強其功能。本研究結果顯示，應用阿托伐他汀后，阿托伐他汀組外周血Treg比例、Foxp3 mRNA表達量和TGF-β蛋白水平均較用藥前升高，Th17及其效應分子表達量降低，提示阿托伐他汀有助于糾正Th17/Treg失衡。阿托伐他汀組術后Th17、Treg比例及其效應分子水平與健康組比較差異仍有統計學意義，提示3個月的阿托伐他汀治療尚不足以完全糾正Th17/Treg失衡，可能需更長時間的用藥，同時也需進一步研究其他改善Th17/Treg失衡的治療方案。

綜上所述，頸動脈粥樣硬化患者外周血Th17比例增加，Treg比例降低，存在Th17/Treg失衡；阿托伐他汀治療有助于糾正Th17/Treg失衡。

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