非小細(xì)胞肺癌組織Twist、N-cadherin表達(dá)及臨床意義

武國(guó)煜，冼磊，莫俊賢，盧銳

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧530021)

Twist是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，具有原癌基因的特性。N-cadherin是由18號(hào)染色體上基因編碼的、相對(duì)分子量為127 000 kD的蛋白，主要功能是參與細(xì)胞黏附、凋亡、增殖、遷移及識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。近年研究發(fā)現(xiàn)，Twist和N-cadherin與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[1～5]，但二者與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系報(bào)道較少。本研究探討Twist與N-cadherin在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2014年6月～2015年5月我院收治的初診NSCLC患者75例(NSCLC組)，男34例、女41例，年齡39～81(56.77±9.32)歲。均行手術(shù)治療，術(shù)后病理檢查證實(shí)診斷。手術(shù)切除腫瘤組織，并留取距離癌組織邊緣>5 cm的正常肺組織。TMN分期Ⅰ期22例、Ⅱ期25例、Ⅲ期16例、Ⅳ期12例，中高分化42例、低分化33例。術(shù)前未經(jīng)任何放化療。對(duì)照組為同期收治的12例行手術(shù)治療的肺部良性疾病患者，男8例、女4例，年齡21～62(44.58±15.12)歲；肺大皰3例、支氣管擴(kuò)張2例、炎性假瘤5例、結(jié)核球2例。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2肺組織Twist和N-cadherin mRNA表達(dá)檢測(cè)NSCLC組取手術(shù)切除的腫瘤組織及其癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)標(biāo)本；對(duì)照組取手術(shù)切除的相應(yīng)病變組織標(biāo)本，組織標(biāo)本離體后15 min內(nèi)放置于-80 ℃冰箱中保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組Twist和N-cadherin mRNA表達(dá)。具體步驟：采用mRNA提取試劑盒(TIGEN公司)按照說(shuō)明書步驟在低溫環(huán)境下提取標(biāo)本總mRNA，采用分光儀根據(jù)OD260/OD280評(píng)估所提取mRNA的質(zhì)量，并計(jì)算mRNA濃度。將提取的mRNA根據(jù)濃度稀釋配比，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIGEN公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(TIANGEN公司)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中Twist和N-cadherin mRNA表達(dá)量。引物及內(nèi)參均由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min、94 ℃變性 20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3肺組織Twist、N-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化SP法。取兩組手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，染色步驟按SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色，并用已知Twist、N-cadherin陽(yáng)性的肺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用枸櫞酸緩沖液PBS代替一抗或橋抗作為陰性對(duì)照。兔抗Twist、N-cadherin單抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。結(jié)果判定：① Twist陽(yáng)性染色主要著位于胞質(zhì)，細(xì)胞核中亦有表達(dá)，以細(xì)胞呈清晰棕色或棕褐色為陽(yáng)性。在高倍鏡下任選 10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)，以細(xì)胞呈清晰的棕色或棕褐色且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>25%為陽(yáng)性，以細(xì)胞無(wú)棕褐色或與背景一致的淡棕色為陰性。② N-cadherin陽(yáng)性染色為棕黃色，定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為陽(yáng)性與陰性。每例切片選擇10個(gè)高倍視野，無(wú)陽(yáng)性著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<20%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%為陽(yáng)性。分析NSCLC組織 Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1兩組Twist、N-cadherin mRNA表達(dá)比較NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁組織和對(duì)照組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　三組Twist、N-cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與癌旁組織比較，△P<0.01。

2.2兩組Twist、N-cadherin蛋白表達(dá)比較NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.3%(55/75)、77.3%(58/75)，癌旁組織分別為18.6%(14/75)、14.6%(11/75)，對(duì)照組分別為0、16.6%(2/12)，NSCLC組癌組織Twist、N-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織和對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3癌組織Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系NSCLC患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期Ⅲ、Ⅳ期者Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ、Ⅱ期者(P均<0.01)，性別、年齡及分化程度對(duì)Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯影響(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4NSCLC組織Twist與N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系NSCLC組53例Twist與N-cadherin均表達(dá)均陽(yáng)性，15例表達(dá)均陰性，Twist陽(yáng)性表達(dá)與N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.583，P<0.01)。

表2　　　　NSCLC組織 Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

Twist在胚胎中胚層時(shí)期就已形成，正常情況下主要表達(dá)于胚胎中胚層、胎盤以及成人某些中胚層來(lái)源的未分化組織[4]。Twist在胚胎發(fā)育期對(duì)促進(jìn)細(xì)胞重建、組織器官形態(tài)構(gòu)建有重要作用，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控許多基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖分化、器官生長(zhǎng)發(fā)育的作用[5]；另外，Twist基因具有原癌基因的特性，能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，Twist在人類多種上皮來(lái)源腫瘤中表達(dá)升高，提示其與癌細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)[6～10]，甚至在某些腫瘤可作為其預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Twist可通過(guò)影響B(tài)mi-1，共同調(diào)控EMT和腫瘤干細(xì)胞樣特性[12，13]。EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的基本過(guò)程，參與多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的形成，其主要特征為E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin表達(dá)上調(diào)；角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細(xì)胞骨架；形態(tài)上由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)特征的細(xì)胞等。這些特征使腫瘤細(xì)胞喪失細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接，侵襲性更強(qiáng)[14]。

N-cadherin通常在來(lái)源于神經(jīng)外胚層和中胚層的器官中表達(dá)較多，如成熟的肌肉、神經(jīng)和造血組織，在正常上皮組織通常不表達(dá)。N-cadherin是Ca2+依賴性的一種跨膜蛋白，主要功能是參與細(xì)胞黏附、凋亡、增殖、遷移及識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，進(jìn)而改變上皮細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)功能，可將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，也就是EMT過(guò)程[15,16]。因此，N-cadherin異常高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其不但可促使癌細(xì)胞從腫瘤組織上脫落，還能使癌細(xì)胞與內(nèi)皮或基質(zhì)成分黏附，使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力大大增強(qiáng)[2]。另外，N-cadherin的異常高表達(dá)有助于血管形成及EMT，從而使腫瘤細(xì)胞更加富于侵襲性，進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)移[17]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織Twist與N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織和良性病變組織，這與在鼻咽癌和宮頸癌中的研究結(jié)果一致[18，19]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Twist與N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與患者的臨床分期和淋巴結(jié)浸潤(rùn)有關(guān)，臨床分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Twist 與N-cadherin表達(dá)水平越高，但二者表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)；上述結(jié)果與Nakajima等[20]在胰腺癌中的研究結(jié)果一致。提示Twist與N-cadherin可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖分化以及腫瘤血管生成，可能作為預(yù)測(cè)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

對(duì)果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，Twist可以激活N-cadherin；在MKN28細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Twist后，細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)上調(diào)[21,22]。本次研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中Twist、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，與Ding等[23]在胃腸間質(zhì)腫瘤中的研究結(jié)果一致，提示兩者協(xié)同表達(dá)可能是由共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，但具體的通路還需進(jìn)一步研究認(rèn)證。

綜上所述，Twist、N-cadherin可促進(jìn)NSCLC的發(fā)生及發(fā)展；在此過(guò)程中二者具有協(xié)同作用。

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