LTBP4過表達對舌鱗狀細胞癌細胞侵襲能力的影響及機制

顧杰林，李正華，葉翀

(貴港市人民醫院，廣西貴港537100)

舌鱗狀細胞癌(簡稱舌鱗癌)的發生位置血管及淋巴管非常豐富，故腫瘤細胞易于轉移[1,2]，患者預后較差。細胞偽足的形成被認為是腫瘤細胞獲得侵襲性的標志之一[3，4]。侵襲性偽足的功能主要為通過基質金屬蛋白酶(MMP)家族降解細胞外基質，進而調控上皮細胞-間充質轉化(EMT)[5]。已有文獻證實，轉化生長因子β(TGF-β)誘導的EMT過程能促進侵襲性偽足的形成和腫瘤轉移[6]。潛伏轉化生長因子β結合蛋白1(LTBP1)被認為是TGF-β誘導EMT通路中重要的調控因子。2017年1～10月，我們觀察了LTBP4過表達對舌鱗癌細胞侵襲能力的影響，現分析結果，探討LTBP4在舌鱗癌發生、發展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料舌鱗癌細胞系TCA8113購自美國ATCC公司，DMEM與FBS購自美國Gibico公司，LTBP4、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指E盒結合蛋白1(ZEB1)、鋅指蛋白(Slug)一抗購自美國Cell Signal Techology，二抗購自北京中杉金橋有限公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，Gelatin購自美國Thermo Fisher公司；Transwell小室購自美國Corning公司。質粒的構建由漢恒生物技術有限公司完成。

1.2CON與LTBP4過表達腺病毒構建CON質粒為空載穿梭pHBAd-CMV-IRES-GFP質粒。LTBP4 CDS序列首先使用PCR合成，模板為293t cDNA，引物序列為Sense: 5′-GTCGACACCGGTATGCCGAGGCCTGGCACCAG-3′，Antisense: 5′-GATAGAAAATAGGTGGTTTTTTAGCTATAGCTA-3′。在合成LTBP4后，首先克隆至pHBAd-CMV-IRES-GFP得到LTBP4-pHBAd-CMV-IRES-GFP穿梭質粒，將2 μg穿梭質粒、4 μg p-BHG(delta)E1,3 cre腺病毒基因組質粒轉入接種于6 cm2平皿的293A細胞中，轉染方式為Lipofectamine2000，步驟根據說明書進行。轉染10天形成病毒空斑，挑起空斑移入新的平皿中，進行擴增，隨后收集感染病毒細胞，反復凍融3次，裂解細胞得到第一代細胞；進一步擴增，待形成第四代細胞時行大量擴增(30個10 cm2平皿)；隨后反復凍融細胞得到病毒，使用氯化銫梯度離心法純化腺病毒，2 000 r/min離心2 h，取2.0 mL 1.40 g/mL與3.0 mL 1.30 g/mL中間乳白色條帶，加入透析袋中，4 ℃過夜，得到LTBP4過表達腺病毒。

1.3細胞培養及分組處理TCA8113細胞培養于37 ℃、5% CO2孵箱中，培養基為DMEM+10% FBS。培養24 h，將細胞分為對照組與LTBP4組，分別感染CON與LTBP4過表達腺病毒，感染復數(病毒數∶細胞數)為100 MOI，感染48 h，換液并行后續試驗。

1.4相關指標觀察

1.4.1細胞LTBP4蛋白表達采用Western blotting法。RIPA裂解細胞后，加入0.2倍體積的5×loading buffer，煮沸15 min后加入預制膠中，50 V電泳20 min，待marker分開時將電壓加至120 V，恒壓電泳至溴酚藍跑到膠板底部，濕法將蛋白電轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入LTBP4一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，加入二抗(1∶500)，37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL液顯色，計算各電泳條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。結果顯示，LTBP4組LTBP4 蛋白相對表達量為24.31±5.87，高于對照組的1.00±0.22(P<0.01)，提示轉染成功。

1.4.2細胞侵襲能力采用Transwell小室法。將兩組細胞重懸于200 μL無血清培養基中，加入Transwell上室，同時在下室加入500 μL完全培養基(DMEM+10% FBS)，12 h后上室正面使用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，風干Transwell小室，并使用0.1%結晶紫染色10 min，棉簽拭去上室正面細胞，顯微鏡拍攝上室背面遷移細胞，使用Image J軟件計數遷移細胞數。實驗重復3次，取平均值。

1.4.3細胞基質降解能力采用基質膠降解實驗。首先將200 μL 50 μg/mL多聚賴氨酸鋪于激光共聚焦小皿，室溫靜置20 min；PBS洗2遍，加入200 μL 0.5%戊二醛，室溫靜置15 min；PBS洗2遍，加入200 μL Gelatin膠，室溫靜置15 min；加入200 μL 5 mg/mL四氫硼酸鈉，PBS洗2遍后即得到Gelatin pig oregon green 488激光共聚焦小皿。兩組細胞血清饑餓處理后，使用TGF-β(2 ng/mL)誘導24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.2% TRIton-X 100破膜，5% FBS室溫封閉30 min，加入5 μg/mL Tritc-鬼筆環肽標記細胞骨架，加入DAPI標記細胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察基質膠降解情況，Image J軟件計算基質膠的降解面積。

1.4.4細胞侵襲性偽足形成情況采用熒光共聚焦顯微鏡觀察。將兩組細胞鋪于激光共聚焦小皿中，待細胞貼壁后，4%多聚甲醛固定，使用0.2% TRIon-X 100破膜，5% FBS封閉，加入兔抗cortactin抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜，加入抗兔的綠色熒光標記二抗(1∶400)，DAPI染核，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細胞，以出現cortactin陽性顆粒作為出現侵襲性偽足的指標，計算侵襲偽足出現的細胞比例。

1.4.5E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達采用Western blotting法。具體方法及結果計算均參照1.4.1。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug、GAPDH一抗濃度均為1∶200。

2　結果

2.1兩組侵襲能力比較LTBP4組侵襲細胞數為(139±32)個，對照組為(343±49)個，組間比較P<0.01。

2.2兩組基質降解能力比較LTBP4組基質膠降解面積為(412.4 ±72.1)μm2，對照組為(1 123±82.3)μm2，組間比較P<0.01。

2.3兩組侵襲性偽足形成情況比較LTBP4組侵襲性偽足出現的細胞比例為(7.23±3.12)%，對照組為(18.24±2.31)%，組間比較P<0.01。

2.4兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達比較見表1。

表1　　　　兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3　討論

LTBP家族是一種EMT糖蛋白，其主要功能為結合TGF-β，促進TGF-β的正確組裝及運輸[5,6]。LTBP與TGF-β在經過特定的蛋白酶或其他因素解離后才能被活化[7,8]。LTBP家族最受關注的功能為通過與TGF-β結合調控TGF-β通路。LTBP包括1、2、3、4 四種蛋白，盡管四種蛋白的結構極為相似，但在腫瘤中的表達截然不同。其中，LTBP4主要在心肌、骨骼肌及平滑肌組織中高表達[9]。研究發現，LTBP4在人與小鼠乳腺腫瘤組織中低表達[10]，通過調節TGF-β表達，參與腫瘤的發生、發展。但LTBP4與EMT通路及腫瘤細胞侵襲性之間的關系尚不明確。

本課題組前期研究發現，LTBP4在舌鱗癌組織中低表達，提示LTBP4低表達可能參與舌鱗癌的發生。本研究中我們首先構建了LTBP4過表達腺病毒，并用該病毒感染舌鱗癌細胞TCA8113，Western blotting檢測結果顯示LTBP4組LTBP4蛋白相對表達量顯著升高，提示LTBP4過表達腺病毒成功感染舌鱗癌細胞。進一步通過Transwell檢測發現，LTBP4過表達可抑制舌鱗癌細胞侵襲。既往文獻報道，LTBP家族與EMT通路的關系密切[11]。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug均為EMT通路的關鍵因子，共同介導EMT過程。在EMT過程中，上皮表型標志物E-cadherin表達下調，間質表型Vimentin表達上調；ZEB1和Slug作為E-cadherin轉錄因子，可通過調控E-cadherin表達，進而調控EMT過程[12]。本研究結果顯示，LTBP4過表達可促進E-cadherin蛋白表達，抑制Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達，提示LTBP4可抑制EMT過程。

在腫瘤轉移過程中，強侵襲性的腫瘤細胞可通過侵襲性偽足降解細胞外基質從而實現轉移[13]。LTBP4已被證實能夠結合于細胞外基質中的TGF-β，從而調控TGF-β的功能[14]。本研究采用基質膠降解實驗檢測LTBP4過表達對細胞外基質降解能力的影響，結果LTBP4組基質膠降解面積顯著降低，初步證實了LTBP4過表達TCA8113細胞的細胞外基質降解能力降低。進一步通過免疫熒光檢測侵襲性偽足標記物cortactin表達，結果顯示對照組中出現圓形粗大的cortactin陽性顆粒，并在細胞腹側面聚集，即認為是侵襲性偽足[15]；本研究LTBP4過表達組該類細胞顯著減少，提示LTBP4在改變EMT通路的同時，能夠通過影響舌鱗癌細胞侵襲性偽足的形成達到對細胞侵襲的調控。

綜上所述，LTBP4過表達可抑制舌鱗癌細胞侵襲；調控EMT信號通路，抑制細胞外基質降解與侵襲性偽足的形成可能是其作用機制。

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