農桿菌介導的玉米自交系Z21遺傳轉化體系的研究

李韓帥，周秒依 ，楊鳳玲，李 婷 ，白琪林 ，劉 亞

（1.山西大學生物工程學院，山西太原 030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原 030031；3.北京市農林科學院玉米研究中心，北京 100097）

玉米作為世界上重要的糧食作物和工業原料之一，在解決糧食安全和資源短缺問題，以及促進國民經濟發展等方面意義重大。FAO統計結果顯示，玉米產量自2001年以來正式超過水稻和小麥，成為世界上產量最大的作物[1]。自新中國成立以來，常規育種在玉米遺傳改良中發揮了重要作用，使得玉米產量至少增加了2倍[2]。隨著分子生物學的日漸成熟，轉基因技術已經逐漸成為玉米品種改良的重要手段。1987年，GRIMSLEY等[3]選擇農桿菌介導轉化法，成功地用玉米條斑病毒的cDNA感染了玉米植株，首次證明農桿菌侵染玉米的可行性；1988年RHODES等[4]首次用基因槍法獲得轉基因玉米完整植株；1996年ISHIDA等[5]用含超雙元載體的農桿菌轉化自交系的幼胚，成功獲得轉基因玉米植株，初步建立農桿菌遺傳轉化體系，在此轉化體系下，玉米的轉化率能夠達到5%～30%，這是農桿菌轉化玉米的一個重要突破。轉基因玉米遺傳轉化研究已進入飛速發展時期。

目前，玉米遺傳轉化的方法有很多，包括基因槍法、農桿菌介導轉化法、花粉管通道法、PEG介導法、電激法和子房注射法等[6]。由于農桿菌介導轉化法具有研究機理相對清楚、外源基因能夠穩定表達和遺傳、轉基因后代拷貝數少，且遺傳穩定性好、成本低且操作簡單等優勢[7]，目前該方法已在全世界范圍內廣泛應用。農桿菌介導玉米遺傳轉化的主要過程包括：農桿菌侵染吸附受體幼胚、農桿菌體內Vir基因激活及T-DNA復合物的產生、T-DNA復合物整合進入植物細胞核的基因組中并表達外源基因[8-9]。影響農桿菌介導轉化的因素包括外植體的類型、幼胚的大小、農桿菌濃度、侵染時間、共培養時間以及抗生素和篩選劑等，都是研究的熱點。其中，愈傷組織誘導和再生主要取決于玉米的基因型[10-11]。通過對離體幼胚的多年研究發現，不同基因型的玉米幼胚抵抗農桿菌侵染的能力差異很大，這直接影響到玉米的轉化效率，而且絕大部分基因型的玉米轉化效率都不高。SCHALAPPI等[12]深入研究農桿菌對玉米幼胚的親和性時發現，感受態細胞是整個農桿菌轉化過程中不可或缺的。相比較而言，再生和整合能力強的感受態細胞更容易得到轉化植株。目前，玉米材料A188和HiⅡ取得了不錯的效果，但農藝性狀較差。

在前期材料篩選的基礎上，本研究選擇其中遺傳轉化效率較高的材料Z21，針對遺傳轉化各個環節的影響條件進行進一步的優化和完善，初步建立高效穩定的遺傳轉化系統，獲得轉基因材料，旨在為加快轉基因育種進程打下堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物材料 試驗所用幼胚取自大田種植的玉米材料Z21，根據氣溫變化情況，選取授粉后8～10 d、幼胚大小為0.5～2.0 mm的玉米幼穗。

1.1.2 菌株和質粒 菌株選用農桿菌EHA105，質粒為pCAMBIA3301，攜帶GUS基因（圖1）。

1.1.3 培養基及成分 培養基及其成分列于表1。

表1 培養基及溶液組分

1.2 方法

1.2.1 活化菌株 從-20℃冰箱取出保存在甘油中的農桿菌菌種，置于冰塊上，待甘油解凍，將接種環經酒精燈灼燒片刻后蘸取菌液，在相應抗性YEP固體培養基上劃線，密封置于28℃培養箱中暗培養2 d。2 d后YEP固體培養基上會出現稀疏不同的菌落，選擇菌落稀少且不重疊的的區域挑取單菌落，接種于50 mL含抗生素（50 μL）的YEP液體培養基中，28℃條件下200 r/min振蕩培養16～20 h。第2天將搖好的菌液離心后去上清，用Inf侵染培養基懸浮農桿菌并調節其 OD600為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5 和 2.0。

1.2.2 幼胚遺傳轉化 取授粉10 d左右、幼胚大小為0.5～2.0 mm的玉米幼穗，除去苞葉，切除果穗頂端和基部1～2 cm，在次氯酸鈉溶液中加入0.1%Tween 20后浸泡幼穗，消毒滅菌20 min，每隔5 min左右上下攪動幾次，以消除籽粒表面的氣泡，從而達到最佳的消毒效果。消毒結束后用無菌水沖洗幼穗籽粒表面，在超凈工作臺內進行剝胚操作，將所得幼胚置于含有1 mL Inf侵染培養液的1.5 mL EP管中待用。

用 OD600為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5 和 2.0的菌液分別侵染待用的幼胚，20℃條件下各自侵染15 min。

1.2.3 共培養 利用帶細槍頭的移液槍吸除農桿菌懸浮液，將幼胚均勻轉移至Coc共培養基中，幼胚盾面朝上放置，間隔1 cm，隨后將Coc培養基放置于培養箱中，24 ℃分別暗培養 1，2，3，4，5 d。

1.2.4 GUS染色鑒定 分別將共培養1～5 d后的部分幼胚用無菌水清洗干凈，放入含有1 mL GUS染色液的EP管中，置于37℃培養箱24 h。通過肉眼或者顯微鏡觀察統計帶有藍斑的幼胚數量，計算GUS染色瞬時表達率。

1.2.5 靜息培養 將共培養后的另一部分幼胚洗菌并用濾紙將幼胚周圍水分吸干，轉移到Res靜息培養基上面，同時用封口膜封住培養皿，28℃條件下暗培養4 d。

1.2.6 選擇階段 靜息培養后，將幼胚轉移至選擇Ⅰ培養基上，大約間隔1.5 cm。培養皿放置于培養箱中28℃暗培養14 d，直至長出1～2 cm的Ⅱ型愈傷組織。統計數量計算Z21的Ⅱ型愈傷率。

將存活且松散的Ⅱ型愈傷組織塊平鋪至選擇Ⅱ培養基上，簡單分離每個愈傷組織塊，使其仍能保持完整性。隨后將培養皿放置于培養箱的塑料盒中28℃暗培養14 d。再次統計數量計算Z21的Ⅱ型愈傷率。

每隔20 d將新長出的陽性愈傷繼代選擇培養一次。

1.2.7 再生階段 把選擇出來的Ⅱ型愈傷組織平鋪到再生Ⅰ培養基上，每個培養基上4個愈傷組織塊，26℃暗培養，直至長出不透明的體細胞胚或不定芽。將體細胞胚或者不定芽轉移到再生Ⅱ培養基上，每個培養皿中只放置1個，26℃條件下按16h∶8 h光周期進行光照培養，直至長出約4 cm的綠芽。把綠芽轉到RⅢ生根培養瓶中，繼續26℃條件下按16 h∶8 h光周期進行光照培養，待長出明顯的根芽為止。

1.2.8 幼苗的生長 將長出根芽的幼苗接到壯苗培養基（長試管）中，26℃條件下按16 h∶8 h光周期培養7～14 d。

1.2.9 轉化植株的檢測 取部分葉片，設計PCR檢測引物（F：GAAGGCACGCAACGCCTACGA；R：CCAGAAACCCACGTCATGCCA），用PCR等分子檢測手段檢測bar基因，通過bar基因的表達情況來驗證目的基因是否被成功導入玉米植株中，記錄陽性植株。等植株長至試管口處時，輕輕移出，室溫下沖洗掉附著在根部的殘余培養基，將植株完整轉移到含營養土的育苗紙盆中。取少量葉片，加入緩沖液后研磨，用試紙條進行轉基因檢測，進一步驗證所得的陽性植株。

2 結果與分析

2.1 幼胚大小對遺傳轉化的影響

由圖2可知，Z21在幼胚大小為1.5～2.0 mm時GUS瞬時表達率達到最大值，為63.5%，明顯高于其他3種幼胚。當換用不同濃度的菌液侵染幼胚時，≥1.5＜2.0 mm的幼胚的GUS瞬時表達率均處于最大值，且更易形成愈傷組織。通過對比發現，在農桿菌濃度逐漸增大的情況下，＜1 mm的幼胚率先大面積染菌，生長停滯甚至褐化死亡，即使存活下來的幼胚也很難形成愈傷組織；而≥2.0 mm的幼胚很容易直接萌發，其愈傷組織的誘導率隨著幼胚的長大逐漸降低，不利于轉基因幼苗的長成。

2.2 農桿菌濃度對遺傳轉化的影響

用 OD600分 別 為 0.3，0.5，0.7，0.9，1.0，1.2，1.5和2.0的農桿菌菌液侵染大小為1.5～2.0 mm的Z21幼胚15 min，24℃培養箱中共培養3 d后進行GUS染色，統計染色數量，結果如圖3所示。

由圖3可知，Z21的GUS瞬時表達率隨農桿菌濃度的增大呈先升后降的變化趨勢，其中，在OD600為0.9～1.2的范圍內，Z21的GUS瞬時表達率達到峰值，且3個濃度間的瞬時表達率相差很小；雖然在OD600為1.5和2.0時也獲得了較高的GUS瞬時表達率，但在后續的多次篩選過程中，大量的Z21幼胚染菌死亡。說明高濃度的農桿菌對幼胚傷害很大，且容易直接影響后期愈傷的生成。綜合各種因素考慮，最終選取OD600＝0.9～1.2為農桿菌最適濃度。

2.3 共培養時間對遺傳轉化的影響

用OD600為0.9的農桿菌菌液侵染1.5～2.0 mm的幼胚15 min，放置24℃培養箱分別培養1～5 d，進行GUS染色檢驗，結果如圖4所示。

從圖4可以看出，當共培養1 d時，Z21的GUS瞬時表達率很低，隨著共培養天數的增加，相應的GUS瞬時表達率也隨之增加；當共培養3 d后，GUS瞬時表達率不再出現顯著的變化。共培養時間的長短能夠直接影響農桿菌對幼胚的吸附能力以及T-DNA的轉移情況。時間過短會導致吸附的農桿菌量少，T-DNA轉移過程不能全部完成；而時間過長也不利于農桿菌的有效控制，容易出現幼胚褐化和水漬化等問題，影響愈傷組織的生成和分化，從而不能再生出完整植株。綜合來看，共培養3 d是農桿菌遺傳轉化的最佳選擇。

2.4 培養基成分對遺傳轉化的影響

2.4.1 基礎鹽對轉化效率的影響 影響玉米幼胚愈傷組織誘導的因素很多，其中，培養基的合理選擇是組織培養過程成功的必要條件。本試驗分別選用了MS鹽和N6鹽培養基，最終均穩定并成功地培育出了所要的轉基因幼苗，且長勢良好。而N6鹽誘導產生的愈傷組織分化再生過程相對較快，更符合試驗需求。所以，在接下來的試驗中均選用N6鹽培養基。

2.4.2 抗生素對轉化效率的影響 抗生素是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。本試驗在組織培養過程中選擇培養基和再生培養基中加入100 mg/L的特美汀，能夠在一定程度上抑制殘余農桿菌對幼胚和愈傷組織的傷害，提高Ⅱ型愈傷率。

“育人”主要反映教師的管理工作尤其是學生管理工作取得的業績。有關評價要素包括：管理工作年限；在師德和管理方面獲得的表彰；育人管理方面的研究成果；指導學生取得的成績。其中，除了“管理工作年限”的認可度為中等外，其他評價要素的認可度均為高。

2.5 抗性愈傷組織的獲得率

根據研究轉化效率的影響因素，選擇幼胚大小1.5～2.0 mm，農桿菌菌液OD600處于0.9～1.2，20℃侵染15 min，共培養3 d，選擇抗生素特美汀為優化轉化條件進行玉米Z21的遺傳轉化，結果表明，在第1次選擇培養階段（SⅠ），共有745個愈傷，符合要求的抗性愈傷431個，抗性愈傷率達57.8%；在第2次選擇培養階段（SⅡ），獲得145個抗性愈傷組織，抗性愈傷獲得率為19.5%。

2.6 轉基因植株檢測

對再生出來的玉米植株提取植株葉片DNA，PCR檢測bar基因，結果如圖5所示，陽性對照出現明亮的條帶，陰性對照無條帶，1～7號符合預期的檢測結果。且在后續的試紙條檢測中，1～7號均出現了明顯的檢測線，可以初步判定，1～7號為轉基因植株。

3 結論與討論

3.1 討論

整個試驗中還存在一些缺陷，例如在試管中培養的組培苗轉移到育苗盆后，長勢很弱，幼苗容易斷根枯死，其成活率顯著下降。所以，在玉米苗期需要加強對幼苗的監管，保證充足的水分、養分和光照供給。

3.1.1 培養基成分對誘導愈傷組織的影響 目前，玉米組織培養體系中按照培養基所含成分不同大體劃分為N6，MS和B5培養基。ISHIDA等[18]成功地選用MS培養基培養出轉基因植株；李世潤等[19]研究認為，相較N6而言，MS更容易作用在胚性愈傷組織的誘導和分化方面；王宏偉等研究發現，用MS培養基培育出的愈傷組織質量相對優于N6培育出的愈傷組織。但是也有研究表明，在組織誘導過程中MS鹽容易產生Ⅰ型愈傷組織，N6鹽更利于產生Ⅱ型愈傷組織[20-21]，而Ⅱ型愈傷組織結構松脆，生長旺盛，色澤鮮艷且增殖很快，符合優良標準的愈傷組織。

3.1.2 殘余農桿菌對幼胚的傷害及影響 在農桿菌介導的遺傳轉化中，共培養后在幼胚的表面和淺層組織中會殘留大量的農桿菌，可能會對幼胚產生額外的傷害，褐化、水漬化甚至死亡，嚴重影響組織培養的過程，所以需要選擇合適的抗生素來抑制農桿菌的生長。目前，使用較多的是頭孢菌素類和青霉素類，但不同的材料和組織對抗生素的敏感程度不同。本試驗選用的特美汀雖然在一定程度上取得了很好的抑菌效果，但部分幼胚仍會出現染菌死亡的情況，較大程度地降低了遺傳轉化率。

3.2 結論

本研究通過對玉米材料Z21的幼胚進行農桿菌介導轉化，在幼胚大小、菌液濃度、侵染時間、共培養時間以及抗生素等方面進行深入地探索，初步建立了適用于Z21的農桿菌介導轉化體系。以GUS染色瞬時表達率為依據，對影響農桿菌介導的主要因素采取控制單一變量的方法，不斷改變變量的大小進行試驗對比探究。本試驗研究表明，在幼胚大小為1.5～2.0 mm，農桿菌菌液OD600處于0.9～1.2，20℃侵染15 min，共培養3 d，選擇合適的抗生素（特美汀）等條件下，Z21的GUS染色瞬時表達率均達到最高值，且在后續的組織培養過程中，愈傷組織的形成和再分化表現良好，能夠穩定地長出轉基因幼苗，證明此遺傳轉化系適用于玉米自交系Z21，符合實際需要。通過該體系可以將抗蟲、抗除草劑、抗旱等有益外源基因導入玉米自交系，豐富轉基因種質資源。

參考文獻：

［1］FAQ.Topproduction-world（total）-2010[EB/OL].[2013-04-10].http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx.

［2］戴景瑞，鄂立柱.我國玉米育種科技創新問題的幾點思考[J].玉米科學，2010，18（1）：1-5.

［3］GRIMSLEYNH，HOHNT，DAVIESJ W，et al.Agrobacterium mediated delivery of infectious maize streak virus into maize plant[J].Nature，1997，325：177-179.

［4］ RHODES C A，PIERCE D A，METTLER I J，et al.Genetically transformed maize plants from protoplasts[J].Science，1988，240：204-207.

［5］ISHIDA Y，SAITO H，OHTA S，et al.High efficiency transformation ofmaize（Zea mays L.）mediated byAgrobacterium tumefaciens[J].Nature Biotechnology，1996，14（6）：745.

［6］張兆熙.轉基因技術的研究綜述及利弊關系[J].科技創業月刊，2006（11）：111-112.

［7］李新征，鄭成超，溫孚江.農桿菌介導的玉米遺傳轉化研究進展[J].生物工程進展，2000，20（6）：19-21.

［8］TZFITAT，CITOVSKYV.Fromhost recognition toT-DNAintegration:the function of bacterial and plant genes in the Agrobacterium plant cell interaction[J].Molecular Plant Pathology，2000，1（4）：201-212.

［9］ZUPAN J，MUTH T R，DRAPER O，et al.The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants：a feast of fundamental insights[J].The Plant Journal，2000，23（1）：11-28.

［10］ AHLOOWALIA B S.Plant regeneration from callus culture of wheat[J].Crop Sci，1982，22：405-410.

［11］ SPENCER T M，GORDON-KAMM W J，DAINES R J，et al.Bialaphos selection of stable transformants from maize cell culture[J].Theoretical&Applied Genetics，1990，79（5）：625-631.

［12］SCHL?PPI M，HOHN B.Competence of immature maize embryos for Agrobacterium-mediated gene transfer[J].Plant Cell，1992，4（1）：7.

［13］張艷貞，王罡，胡漢橋，等.農桿菌介導將Bt殺蟲蛋白基因導入優良玉米自交系的研究[J].遺傳，2002，24（1）：35-39.

［14］李慧芬，何鍶潔，王興智，等.玉米優良自交系愈傷組織基因槍轉化的研究[J].遺傳學報，1999（4）：397-402.

［15］劉紀華，施介村.青飼玉米有益突變體篩選的研究[J].植物生態學報（英文版），1996（10）：839-842.

［16］KAMO K K，BECWAR M R，HODGES T K.Regeneration of Zea mays L.from embryogenic callus[J].Botanical Gazette，1985，146（3）：327-334.

［17］ESCUDEROJ，NEUHAUS G，SCHL?PPI M，et al.T DNA transfer in meristematic cells ofmaize provided with intracellular Agrobacterium[J].Plant Journal，1996，10（2）：355-360.

［18］ ZHAO Z Y，CAI T，TAGLIANI L，et al.Agrobacterium-mediated sorghum transformation[J].Plant Molecular Biology，2000，44（6）：789-798.

［19］李世潤，張舉仁，陳惠民.玉米胚性愈傷組織誘導和植株再生的研究 [J].山東大學學報 （自然科學版），1990，25（1）：116-121.

［20］ARMSTRONG C L，GREEN C E.Establishment and maintenance of friable，embryogenic maize callus and the involvement of L-proline[J].Planta，1985，164（2）：207-214.

［21］ ELKONIN L A，PAKHOMOVA N V.Influence of nitrogen and phosphorus on induction embryogenic callus of sorghum[J].Plant Cell Tissue&Organ Culture，2000，61（2）：115-123.