紅三葉遺傳圖譜構建及抗白粉病基因QTL定位

蒲小劍，田久勝，田新會，杜文華

(甘肅農業大學草業學院,草業生態系統教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業可持續發展研究中心, 甘肅 蘭州730070)

紅三葉(Trifoliumpratense)為豆科三葉草屬中最重要的一種牧草，其青干草中富含異黃酮，具有調節人體新陳代謝，抗腫瘤、心血管疾病、骨質疏松癥、早老年性癡呆癥、婦女更年期綜合征、機體免疫力下降等作用[1]，在預防骨質疏松癥、更年期綜合征及治療胃潰瘍、胃癌、乳腺癌、腸癌和前列腺癌等方面具有特殊功效，是保健食品業和醫藥生產中提取異黃酮的重要原料[2-3]。

岷山紅三葉(T.pratensecv. Minshan)是1944年從美國引進，經過多年栽培馴化，選育出的適宜于甘肅省高寒陰濕區種植的特有牧草種質資源。其青干草中粗蛋白含量為19.75%，異黃酮含量為4.796 μg·mg-1，是大豆(Glycinemax)的8～10倍[2]。近年來，其種植面積不斷擴大[4]。但在長期種植過程中，由于品種更新緩慢、退化嚴重，重度感染白粉病(感病率達70%)，對單位面積草產量和異黃酮提取量影響極大[5]。因此，培育適宜于該區種植的抗白粉病紅三葉新品種，成為農牧業生產中亟待解決的問題。

雜交育種、誘變育種和雜種優勢利用等常規育種技術均能達到培育新品種的目的。轉基因育種技術能有效彌補傳統育種的不足，打破物種間的界限，使品種選育快速、高效、定向[6]，能夠有針對性地改良和選育作物新品種[7]。遺傳圖譜構建和相關性狀基因定位是基因克隆和轉基因育種的前提[8]。

分子遺傳圖譜構建作圖群體主要分臨時性和永久性兩大類，常用的標記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SRAP等。構建某一植物的圖譜時，具體選用何種標記，要依據具體研究情況決定[8]。國內外學者利用不同標記構建了不同植物的遺傳圖譜，就是同一種植物，也可以利用不同分子標記構建遺傳圖譜[9-12]。AFLP標記是一項結合了RFLP和PCR技術特點的全基因組分子標記。它具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性，只需要極少量DNA材料，而且不需要預知基因組DNA序列特征，不需要Southern雜交，試驗結果穩定可靠，可以快速獲得大量信息，而且再現性高，重復性好，因而非常適合于品種指紋圖譜繪制，遺傳連鎖圖譜構建及遺傳多樣性研究，很快便成為植物分子遺傳圖譜構建的主要標記[13]。在一些多態性極少，而且待測樣品較少的情況下，用AFLP分析能達到滿意結果。徐志等[9]利用AFLP標記構建了小麥(Triticumaestivum)白粉菌遺傳連鎖圖譜。其他學者也先后利用AFLP標記構建了水果[14]、蔬菜[15-17]、棉花[18]、大豆[19]等作物的遺傳圖譜。AFLP也是高密度基因圖譜繪制或對某個基因所在區域進行精細定位較為理想的方法[9]。AFLP是目前農牧業生產中構建遺傳圖譜和基因定位應用最多的分子標記[19]。

岷山紅三葉為異花授粉植物，品種的遺傳背景不一致，群體內存在遺傳多樣性。白粉病抗性由單基因(質量性狀遺傳位點)或多基因(數量性狀遺傳位點)控制[5]。目前國內外在植物中共檢測到白粉病QTLs44個，這些抗白粉病QTLs分布在A、B和D染色體組里，在同源群間，第5群中檢測到QTL最多[11]。對抗白粉病基因的定位主要集中在小麥、黃瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)和草莓(Fragaria×ananassa)等植物上，小麥抗白粉病基因定位方面的研究尤為突出[12]。國際小麥基因命名委員會正式命名了來自39個位點的55個抗白粉病基因(Pm1～Pm39)，其中30個已找到連鎖的分子標記[11]。這些眾多的分子標記類型中，以SSR、AFLP和SRAP應用最為廣泛。劉聯正等[11]利用SSR標記將小麥抗白粉病基因PmWP6192定位于2AL染色體上，劉素蘭等[12]利用SSR技術將小麥新種質N9628-2的抗白粉病基因定位在6AS上，李春鑫等[20]利用SSR和SRAP標記將抗小麥白粉病新基因PmHNK定位于3BL，Alfandi等[21]利用AFLP標記將黃瓜中的抗白粉病基因定位在5BL上，Fernando等[22]利用SSR和AFLP標記將甜瓜的抗病基因定位在2AL染色體上。目前國內外利用AFLP標記構建紅三葉遺傳圖譜及抗白粉病QTL定位方面的報道較少。本研究擬以紅三葉抗、感白粉病材料雜交得到的F1代為作圖群體，利用AFLP標記構建紅三葉高密度遺傳圖譜，并對抗白粉病QTL進行定位，為抗白粉病基因克隆和轉基因等分子輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗田間部分在甘肅省臨洮縣臨洮農校農場進行，E 103°87′，N 35°37′。海拔1892 m，降水量562 mm，無霜期80～190 d，年平均氣溫7.0 ℃(最高氣溫34.6 ℃，最低氣溫-29.5 ℃)，土壤為黑麻土，有灌溉條件，試驗地肥力均勻。前茬作物為玉米(Zeamays)。

1.2 試驗材料鑒定及接種

以重度感染白粉病岷山紅三葉為父本(male parent，M)、甘肅農業大學培育的高抗白粉病紅三葉新品系“甘農PR1”(據任繼周[23]病害調查與研究方法分別確定為重感和高抗，數據未發表，其中新品系“甘農RP1”為育種用試驗材料)為母本(female parent，F)雜交形成F1代群體以及親本。2015年3月下旬將雜交F1代種子點播，株距20 cm，行距30 cm，播種深度1～2 cm，得到F1代群體。利用項目組前期研究篩選出的11對AFLP引物對提取自紅三葉親本及雜交F1代群體的基因組DNA進行電泳(JY-ECP3000高壓電泳儀-北京君意東方電泳設備有限公司；JY-SPFT水平電泳槽-北京君意東方電泳設備有限公司)。根據電泳圖譜條帶特征，淘汰假雜種，保留真雜種，用于構建遺傳圖譜。參照文獻[5]的白粉菌接種方法和侵染型記載標準，于2015年6月中旬為F1代群體和父母本苗期人工接種白粉菌，待岷山紅三葉6月底充分發病后，記載F1代群體中每個單株的侵染型。從F1代群體中分別隨機選取15株抗病和感病單株，采用改良CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)法[9]分別提取DNA(TGL16M型臺式高速冷凍離心機-湖南凱達科學儀器有限公司；水浴鍋)，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和純度(PCR擴增儀-BioRad-MyCycler；紫外凝膠成像儀-UVP GDS-8000；超微量紫外分光光度計-Quawell-Q5000；相機)，OD260/280為1.8±0.1，符合試驗要求。提純合格后的DNA樣置于4 °C冰箱內保存備用。5次重復進行實驗。

1.3 試劑

MseI、EcoRI和T4DNA連接酶均購自Thermo Scientific；2×PCR Master Mix，DNA Marker均購自BBI Life Sciences；引物及接頭(表1)由上海生工生物工程(上海)有限公司人工合成；其他試劑均為國藥分析純。

表1 接頭和引物序列Table 1 The sequence of adapter and primer

1.4 AFLP分析

參照Vos等[24]的方法，略作調整。分步法酶切體系：200～300 ng DNA 9.0 μL、10×Tag Buffer 3 μL、8 UEcoRI，6 UMseI，ddH2O補齊20 μL。37 ℃水浴5 h、65 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。連接體系：單鏈人工接頭加ddH2O稀釋至50 μmol·L-1，經PCR反應合成雙鏈，加入3 U T4DNA連接酶，于22 ℃下連接過夜。接頭制作：將合成的人工單鏈稀釋至50 μmol·L-1，經PCR反應94 ℃，5 min；65 ℃，10 min；37 ℃，10 min；25 ℃，10 min；4 ℃保存。合成雙鏈接頭，-20 ℃保存備用。預擴增體系：連接產物模板DNA 4 μL、0.8 μLEcoRI，0.6 μLMseI預擴增引物，15 μL 2×PCR Master Mix，然后ddH2O補平，離心混勻進行PCR反應。PCR反應程序：94 ℃ 2 min進行變性；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行擴增，共35個循環；72 ℃ 10 min進行延伸，-20 ℃保存備用。選擇性擴增體系：2.0 μL稀釋30倍的預擴增產物，Primer E，0.8 μL；Primer M，1.0 μL；2×PCR Master Mix，10 μL；ddH2O，6.2 μL。PCR反應程序：94 ℃ 2 min進行變性；65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，每個循環開始溫度下降0.7 ℃，共擴增13個循環；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共擴增23個循環；-20 ℃保存備用。

1.5 擴增產物檢測

制備4%變性聚丙烯酰胺凝膠，待膠聚合后恒電壓1800 V預電泳30 min。將PCR擴增產物(2 μL)與上樣Buffer混合均勻，經90 ℃變性3 min后，置于4 ℃保存等待點樣。點樣后1500 V恒功率電泳1.5 h左右。采用Carlos銀染方法[25]，膠版微干后拍照、并統計數據。

1.6 統計與分析

以30個F1群體真雜種個體及雙親共32個單株的基因組DNA為PCR模板，用11對AFLP引物進行PCR擴增。讀帶的原則：記錄清晰、明確的條帶；模糊、不易辨認的條帶不做紀錄。同一位點有帶記為“H”，無帶記為“A”，缺失用“-”表示。AFLP標記名稱由引物組合編號和多態性條帶序號組合而成。由同1對引物組合擴增出多個多態性條帶，分別記為引物組合名-01、-02，依此類推如E3M4-01，E3M7-05等。最后按軟件JoinMap 4.0的作圖格式要求對獲得的標記基因型數據進行整理和編輯。

利用JoinMap 4.0軟件[26]構建遺傳圖譜的過程：File—New Project—Load Data，分別將基因型數據導入JoinMap 4.0作圖軟件；然后運行Data—Locus Genot. Freq.—Calculate Dudo，對標記進行卡方檢驗，剔除偏分離標記；接著運行LOD Groupings (tree)窗口下的Calculate命令，對各標記間的連鎖關系進行分組，圖距也由Calculate命令計算出來；然后根據計算后不同的分組，運行Population—Create Groups using the Groupings Tree，選擇適宜的LOD值(2～10)在Population菜單下分別構建各個基因連鎖群；然后運行Group—Calculate Map命令對每個連鎖群創建連鎖圖；最后用Export命令導出結果。

利用本試驗構建的紅三葉AFLP圖譜和MAPQTL 6.0軟件[27]對抗白粉病有關QTL進行定位分析，并計算各位點性狀的育種值和貢獻率。

2 結果與分析

2.1 紅三葉遺傳圖譜構建

基于149個AFLP標記構建的紅三葉基因連鎖圖包含7個連鎖群(LG1～LG7)(圖1，表2)。所獲得連鎖圖譜總距離為640.5 cM，標記間平均距離4.3 cM。各連鎖群的距離為55.2～140.6 cM，標記數為10～33，標記間的距離為1.8～9.4 cM。其中，連鎖群LG1的遺傳距離(140.6 cM)最大，包含15個AFLP標記，標記間平均距離為9.4 cM；LG2的遺傳距離為70.6 cM，包含19個AFLP標記，標記間平均距離為3.7 cM；LG3的遺傳距離為110.3 cM，包含23個AFLP標記，標記間平均距離為4.8 cM；LG4的遺傳距離(55.2 cM)是所有連鎖群中最小的，但包含31個AFLP標記，標記間平均距離為1.8 cM；LG5的遺傳距離為83.2 cM，包含10個AFLP標記，標記間平均距離為8.3 cM；LG6的遺傳距離為122.9 cM，包含的AFLP標記最多(33個)，標記間平均距離為3.7 cM；LG7的遺傳距離為57.7 cM，包含18個AFLP標記，標記間平均距離為3.2 cM。

2.2 紅三葉抗白粉病基因QTL分析

利用MAPQTL 6.0對紅三葉抗白粉病QTL進行定位分析(圖1)。LOD≥2.0時，檢測到5個與紅三葉抗白粉病性狀有關的QTL，分別定位于遺傳圖譜的LG4和LG5連鎖群(圖1中陰影部分)。

圖1 紅三葉遺傳圖譜及抗白粉病QTL定位Fig.1 Linkage map and QTL analysis on powdery mildew resistance in red clover 圖中LG4和LG5的陰影為紅三葉抗白粉病QTL位點。Shadows on LG4 and LG5 mean QTLs resistant to the powdery mildew in red clover.

5個與紅三葉抗白粉病相關的QTL暫命名qrp-1，qrp-2，qrp-3，qrp-4和qrp-5，其中qrp-1、qrp-2、qrp-3和qrp-4位于LG4連鎖群上，qrp-5位于LG5連鎖群上。5個QTL位點的加性效應均為負值，對抗白粉病表現增效加性效應，其中qrp-1最小(-2.22)，qrp-4最大(-1.11)(表3)。在5個QTL位點中，qrp-1的遺傳距離為4.6 cM，包含的AFLP標記數最多(3個)，其LOD值(10.45)和對紅三葉白粉病抗性的貢獻率(90%)最大，為主效基因；qrp-2的LOD值(3.28)次之，包含2個AFLP標記，其加性效應和貢獻率分別為-1.48和39%；qrp-5的遺傳距離最大(6.1 cM)，但包含的位點數最少(0)，LOD值(2.44)和貢獻率(31%)相對較低，其也是唯一一個不在LG4連鎖群上的QTL位點。

3 討論

3.1 作圖群體的選擇

作圖群體的選擇是影響遺傳圖譜構建和圖譜質量好壞的主要因素之一，常見遺傳連鎖圖譜作圖群體有臨時性作圖群體和永久性分離群體，臨時性作圖群體包括雜交F1代、F2代和F4代群體[28-30]。永久性分離群體包括近等基因系群體、雙單倍體群體、重組自交系群體、回交自交系群體[31-34]。如果植物的親本基因型雜合度較高，則F1分離作圖群體為適宜作圖群體[28]。包括紅三葉在內的大多數多年生牧草為異花授粉植物，親本高度雜合，自交不親和，選育高純度自交系相對較難，構建回交群體有一定阻礙[28]。雜交F1代是大多數牧草分子遺傳連鎖圖譜構建的常用作圖群體，已應用于紫花苜蓿(Medicagosativa)[35]、紅三葉[36]、鴨茅(Dactylisglomerata)[37]、黑麥草(Loliumperenne)[38]和高羊茅(Festucaelata)[39]等牧草。

表2 紅三葉遺傳連鎖圖譜中各連鎖群的圖距和標記分布Table 2 Genetic distance and distribution of markers in the linkage groups of red clover

表3 紅三葉抗白粉病性狀的QTL分析Table 3 QTL analysis of powdery mildew resistance in red clover

3.2 作圖標記的選擇

DNA分子標記直接體現植物DNA水平上的遺傳多樣性，因為其易操作、不易受環境影響和可重復性強等優點，在牧草遺傳圖譜構建研究中應用廣泛。現階段，SRAP、AFLP、SSR、RFLP和RAPD等分子標記是遺傳作圖的主要方法。遺傳圖譜構建的關鍵在于選取適宜的標記系統。實踐證明，AFLP的多態性條帶在圖譜上定位的比例非常高，能夠滿足構建遺傳連鎖圖譜要求[40-42]。荷蘭Keygene公司和PE公司共同構建了擬南芥(Arabidopsisthaliana)遺傳連鎖圖譜，共有700多個AFLP位點，擬南芥的全部基因組在圖譜中體現的非常好[43-44]。Jaime等[45]利用AFLP結合27個形態學性狀，對馬鈴薯(Solanumtuberosum)多態性水平及其親緣關系進行了研究。

3.3 遺傳圖譜構建

牧草的草產量、品質和非生物抗性等性狀往往具有連續的表型變異，并且由多個數量性狀位點調控[46-48]。前人主要利用回交法，對具有優良性狀的親本進行改良，其育種時間較長，效率十分低[46]。分子遺傳連鎖圖譜不僅能夠在分子層面分析，而且可以對主要農藝性狀的基因進行標記、定位和基因克隆，并可以將目標基因轉入到特定植物中[48]。利用轉基因等分子標記輔助育種，可加快牧草育種進程[49]。

一般而言，連鎖框架圖要求標記間平均間隔要小于20 cM。如果標記間的平均距離為10～20 cM或更小時，就可以進行主基因定位[50]。本試驗由149個AFLP標記構建的遺傳圖譜，全長640.5 cM，標記間平均距離為4.3 cM，平均間距1.8～9.4 cM。圖譜標記分布均勻，可用于QTL定位。

3.4 抗白粉病QTL定位

近年來QTL定位研究是國內外高度重視的一種方法，其發展非常迅猛。最初使用傳統的單標記分析法[51]，然后發明了利用兩個側鄰標記的區間作圖法[52]，后來發展為在模型中加入其他類型標記，以減少遺傳背景效應誤差的復合區間作圖法[36]，目前QTL定位最先進的方法是多重區間作圖法[53]。多重區間作圖法能夠對單一QTL進行快速、有效定位[37,51]。本研究以抗、感白粉病紅三葉材料雜交形成的F1群體為作圖群體，構建AFLP遺傳圖譜，并利用多重區間作圖法對抗白粉病QTL進行定位分析，可以為紅三葉分子輔助育種奠定基礎。

4 結論

本試驗利用紅三葉雜交F1代群體為作圖群體，由149個AFLP標記構建得到7個連鎖群(LG1，LG2，LG3，LG4，LG5，LG6和LG7)。所獲得遺傳圖譜的總距離和標記間平均距離分別為640.5和4.3 cM。在所得連鎖圖譜中，LG4遺傳距離最小(55.2 cM)，包含的標記數高達31個，標記間平均距離最小(1.8 cM)，是所有連鎖圖譜中最密集的。

應用區間作圖法對紅三葉抗白粉病基因進行QTL分析定位，共檢測到5個與抗白粉病相關的QTL位點(qrp-1，qrp-2，qrp-3，qrp-4和qrp-5)，分布在LG4和LG5連鎖群上，其中LG4上含有4個QTL位點。qrp-1對紅三葉白粉病抗性的貢獻率最大(90%)，為主效QTL。

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