FOXM1在人類結腸癌中的表達及意義＊

曹原，堯陽揚，郭惠，劉鎮，熊建萍

(南昌大學第一附屬醫院腫瘤科，南昌 330006)

結腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重威脅我國居民健康。在我國，隨著人群生活方式的日益西化以及過多高脂高熱食物的攝入、肥胖、吸煙以及缺乏鍛煉等因素，結直腸癌的發生率正在日益攀升，縱使目前手術技術及新輔助化療在結直腸癌早期診斷及治療上取得了一定的進步，但對結直腸癌伴遠處轉移的病人，其5年生存率仍在12.5%以下。結腸癌患者絕大多數初診時已為晚期，其病情進展快、預后差[1]。結腸癌的早期診斷技術落后是導致結腸癌死亡率及復發率高的主要原因，由于其確切的分子機制仍不甚清楚，目前缺乏有效的預防和治療措施。最近多項研究表明基因突變與結直腸癌的預后及治療密切相關，鑒于此，很多的分子靶向治療藥物應運而生[2-5]。因此，探討發現結腸癌的新型腫瘤標志物和治療靶點，對于結腸癌的早期診斷、預后判斷和指導治療意義重大。

Forkhead Box轉錄因子家族成員轉錄因子叉頭盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FOXM1）是叉頭盒蛋白家族重要的成員，是一種增殖相關的致瘤性的轉錄因子，具有在進化上保守的螺旋翼狀(Winged Helix)DNA結合域。FOXM1的表達僅局限于成人組織分裂活躍的細胞中，例如胸腺、睪丸、結腸和小腸，然而在靜止期或分化的細胞中幾乎不表達[6，7]。目前研究已證實FOXM1的表達對多種腫瘤細胞的發生發展起到至關重要的作用。大量基因芯片分析結果顯示FOXM1在超過20種實體腫瘤中高表達，如肝細胞癌、胰腺腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌以及結直腸癌等[8-14]。FOXM1在細胞增殖、凋亡、細胞周期進展、血管生成、EMT、DNA損傷修復和代謝等許多生理過程中發揮重要作用?，F已證實FOXM1可通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinase-typeplasminogenactivator receptor）促進結腸癌細胞侵襲及轉移[14]。最近，一些研究已經表明，FOXM1可增強DNA損傷修復基因，如乳腺癌相關基因（BRCA2），X線交叉互補基因 1（XRCC1）和 RAD5 的表達[16，17]，而敲除 FOXM1顯示降低了結腸癌細胞DNA復制[18]。

在本項研究中，我們用生物信息學網站GEPIA證實了絕大多數腫瘤中FOXM1的基因表達量都有不同程度的增加，同時查詢生物信息學網站cBioPortal發現結腸癌中FOXM1的基因變異率較高，同時我們運用westren boltting技術比較結腸癌組織及其相對應的臨近非癌組織中FOXM1蛋白的表達水平，發現在結腸癌組織中FOXM1的表達比鄰近非癌組織中的表達水平更高。這些結果表明，FOXM1在人類結腸癌中的表達量有所增加，并可能成為結腸癌患者的新型預后因子。

1　材料和方法

1.1臨床標本該研究方案經南昌大學第一附屬醫院批準。在知情同意的情況下收集結腸癌患者的新鮮腸癌手術標本及對應的非癌組織共4對。

1.2蛋白質印跡從新鮮組織中提取總蛋白，并用冰冷的裂解緩沖液裂解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜，然后用針對FOXM1（Abgent，USA）和 β-肌動蛋白（Affinity，USA）的一級抗體進行免疫印跡，其次是辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗（ZSGB，中國）。使用化學發光溶劑（Thermo，USA）檢測信號。

2　結果

2.1各腫瘤樣本及其配對正常組織的FOXM1的mRNA表達情況本研究中，我們使用生物信息學網站 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）對 FOXM1在人類各惡性腫瘤樣本及其配對正常組織樣本中的mRNA表達情況進行分析。結果表明，在絕大多數樣品中FOXM1在腫瘤組織中的mRNA表達中值均大于其配對的正常組織樣品 （圖1A和1B）。其中在結腸癌樣品中的FOXM1的mRNA表達中值為30.78PTM，而在相應正常組織中的表達中值為2.47PTM。

圖1　圖1A GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對的正常組織的FOXM1 mRNA表達譜。注：縱坐標代表腫瘤類型或正常組織中FOXM1的mRNA表達中值。圖1B GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對的正常組織的FOXM1 mRNA表達散點圖

2.2FOXM1在結直腸癌中DNA的改變情況為了進一步探討FOXM1基因在結腸癌中表達情況，對FOXM1在結直腸腺癌中的改變頻率及情況進行信息挖掘。一項研究統計了249例結腸腺癌患者FOXM1基因改變的情況，這些病例中有高達2.81%的病例出現FOXM1基因的改變，其中2.01%為突變，0.4%為擴增，0.4%為多重改變；還有一項統計數據針對122例直腸腺癌患者，這些病例中有高達2.46%的病例出現FOXM1基因的改變，其中1.64%為突變，0.82%為擴增；更有說服了的是，來自cBioPortal數據庫的一項更大樣本量的統計同時納入了結腸腺癌和直腸腺癌患者，發現在2001例結直腸癌病例中有0.8%的病例出現FOXM1基因的改變，其中0.75%為突變，0.05%為擴增（見圖2A）。說明FOXM1在結直腸癌，尤其是結腸癌中的存在高頻率的DNA突變現象。

2.3結腸癌組織中FOXM1蛋白的表達較臨近非癌組織高在查詢和挖掘上訴生物信息學依據之后，我們通過westren blotting技術對4對結腸癌及其鄰近非癌組織進行FOXM1蛋白質表達分析，以驗證結腸癌中FOXM1在蛋白水平的表達。結果顯示：4對組織中，結腸癌組織中FOXM1蛋白的表達比鄰近非癌組織中的表達水平更高（圖3A）。

圖2　圖2A cBioPortal(http：//www.cbioportal.org)中3項數據顯示FOXM1在結直腸癌中的DNA的改變情況。

圖3　圖3A 6對結腸癌及其鄰近非癌組織的FOXM1表達水平

3　討論

Forkhead Box轉錄因子家族成員FOXM1是一種進化上保守的致癌性轉錄因子。FOXM1在細胞增殖、凋亡、細胞周期進展、血管生成、EMT、DNA損傷修復和代謝等許多生理過程中發揮重要作用。有研究表明，FOXM1表達與晚期非小細胞肺癌患者的預后不良相關，并且與非小細胞肺癌的上皮間質轉化有關[19，20，21]。 在白血病細胞中，miR-370的異位表達通過靶向抑制FOXM1表達，誘導細胞生長停滯和衰老[22]?，F已證實FOXM1可通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinasetype plasminogen activator receptor）促進結腸癌細胞侵襲及轉移[15]。FOXM1還可增強DNA損傷修復基因，如乳腺癌相關基因（BRCA2），X線交叉互補基因 1 （XRCC1） 和 RAD51的表達[16，17]。 此外，Yoshida等[18]發現FOXM1基因敲除小鼠結腸癌細胞DNA復制及生長能力顯著減弱。一項研究表明，FOXM1靶向Nijmegen破壞綜合征1（NBS1）來調節DNA損傷誘導的乳腺癌細胞衰老[22]。miRNA在結腸癌中的研究也越來越多[23]，既往的文獻表明多種miRNA可以靶向FOXM1參與調控結腸癌細胞的耐藥[22，24]。

在本項研究中，我們通過在生物信息學網站，挖掘了人類各腫瘤樣本中FOXM1的表達情況，發現在絕大多數人類腫瘤樣本中FOXM1的表達中值均大于正常組織，這表明，FOXM1的異常表達在腫瘤的發生和發展中起著關鍵作用。FOXM1在結直腸癌中基因突變和擴增比較頻繁，基因水平的異常改變是FOXM1表達異常的重要原因之一。通過大數據我們證實了FOXM1在結腸癌中的DNA改變頻率較高，mRNA的表達較正常組織高，并且我們結合實驗證實腫瘤中FOXM1在蛋白水平上表達較正常組織亦增高。因此我們認為FOXM1作為結腸癌患者新的治療靶點及預后生物指標是有意義的。

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