一株叢毛單胞菌對(duì)2-吡啶甲酸的好氧生物降解

王巧蕊, 程星星, 范宇睿, 鄭春莉, 沈振興, 韓文昊

(西安交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系, 710049, 西安)

吡啶及其衍生物具有高毒性和致癌性,已被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局列為優(yōu)先控制污染物[1]。吡啶類化合物屬于氮雜環(huán)化合物,其廢水主要來(lái)源于采礦、采煤、頁(yè)巖油開采、木材防腐處理、食品和醫(yī)藥等行業(yè)[1-3]。

2-吡啶甲酸是一種重要的吡啶類化合物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、日用化學(xué)品以及畜牧業(yè)食品添加劑的生產(chǎn)中[4-7]。2-吡啶甲酸在水中具有極高的溶解性,在20 ℃下的溶解度為887 g/L,且可長(zhǎng)期穩(wěn)定地存在于水體中,進(jìn)而對(duì)環(huán)境和人體造成危害。據(jù)報(bào)道稱,好氧生物法可有效去除水中的2-吡啶甲酸[8],降解菌主要包括節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[9]和鏈霉菌屬(Streptomyces)[10]。然而,現(xiàn)有文獻(xiàn)尚未定量描述2-吡啶甲酸的好氧生物降解特性,此外,2-吡啶甲酸是否可以被其他菌屬的微生物降解利用亦未見報(bào)道[1-2]。

本文分離篩選了一株在好氧條件下以2-吡啶甲酸為唯一碳、氮、能源的新菌株,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)和核酸序列同源性分析進(jìn)行了分類鑒定,考察了環(huán)境因子對(duì)菌株降解2-吡啶甲酸的影響,并建立了降解動(dòng)力學(xué)模型,旨在為含2-吡啶甲酸類廢水的微生物處理提供科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用試劑:2-吡啶甲酸(色譜純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)、甲酸(色譜純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%),購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;甲醇(色譜純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.90%),購(gòu)自美國(guó)Fisher Chemical公司;其他試劑,均為國(guó)產(chǎn)分析純;超純水(電阻率為18×106Ω/cm)。

實(shí)驗(yàn)用儀器:高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF-MS,日本島津);液相色譜儀(S600,德國(guó)Sykam);光電二極管矩陣檢測(cè)器(S3350,256位);總有機(jī)碳分析儀(ET1020A,上海歐陸科儀有限公司);掃描電鏡(Hitachi TM-1000,日本日立);PCR儀(2720 thermal cycler,美國(guó) Applied Biosystems,ABI);DNA測(cè)序儀(ABI PRISMTM3730XL,美國(guó)Applied Biosystems,ABI);紫外可見分光光度計(jì)(TU1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2　菌株分離鑒定與形態(tài)觀察

以某污水處理廠曝氣池中的活性污泥為菌源,在質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的2-吡啶甲酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中進(jìn)行富集篩選,溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min,得到以2-吡啶甲酸為唯一碳、氮、能源的菌液,然后在固體培養(yǎng)基上純化,分離出3株2-吡啶甲酸降解菌,分別命名為ZD1、ZD2和ZD3。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的配制方法見文獻(xiàn)[11]。固體培養(yǎng)基由瓊脂(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%)、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液和2-吡啶甲酸(100 mg·L-1)組成。

選取ZD3做進(jìn)一步研究,其16S rRNA基因測(cè)序由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。登錄GenBank,通過(guò)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較,并采用MEGA 6軟件通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

將菌株ZD3接種至含100 mg·L-12-吡啶甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,于30 ℃、150 r/min下振蕩12 h;移取菌液,于4 ℃、2 000 r/min下離心10 min,去除上清液,收集細(xì)胞。使用掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)觀察,細(xì)胞樣品的預(yù)處理可參見文獻(xiàn)[11]。

1.3　2-吡啶甲酸降解

將菌株ZD3分別接種至含100 mg·L-12-吡啶甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(pH值范圍為3.0～12.0)以及含100～800 mg·L-12-吡啶甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(pH=7.0)中。于30 ℃、150 r/min下進(jìn)行振蕩,并在不同時(shí)間間隔內(nèi)移取菌液,再于4 ℃、8 000 r/min下離心15 min,收集上清液,用0.22 μm膜過(guò)濾3次,獲得樣品。每個(gè)樣品進(jìn)行總有機(jī)碳(TOC)、2-吡啶甲酸質(zhì)量濃度(液相色譜法)、pH值、紫外掃描和HPLC-IT-TOF-MS分析。每個(gè)樣品均重復(fù)分析3次,取平均值。

對(duì)照實(shí)驗(yàn):將ZD3滅活(1×105Pa,30 min),接種至以2-吡啶甲酸為唯一碳、氮、能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,其余操作條件同上。

1.4　液相色譜分析

色譜柱為Reprospher 100 C18(5 μm,150 mm×4.6 mm,德國(guó)Sykam生產(chǎn));流動(dòng)相為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸的水-甲醇體系(體積比為90∶10),流速為1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;進(jìn)樣體積為20 μL;柱溫為30 ℃。

2　結(jié)果與討論

2.1　菌株分離鑒定與形態(tài)觀察

圖1顯示了菌株ZD3在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征:米白色、不透明,形狀不規(guī)則,大小不均勻,表面粗糙、扁平,邊緣不整齊,菌落與培養(yǎng)基表面結(jié)合緊密,難以挑起。

圖1　ZD3的菌落形態(tài)特征

圖2為ZD3的掃描電鏡照片,可以看到細(xì)胞呈短桿狀,長(zhǎng)度在1～2 μm之間。由系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)可知,菌株ZD3(序列號(hào)KP900021)與Comamonassp.VT3的相似性高達(dá)100%,因此ZD3鑒定為叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)。叢毛單胞菌包括土生叢毛單胞菌、食酸叢毛單胞菌、水生叢毛單胞菌、睪丸酮叢毛單胞菌等[12]。近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)叢毛單胞菌可用來(lái)處理含多環(huán)芳烴、喹啉、膽固醇、甾體化合物、硝基苯等的污染廢水[13]。然而,關(guān)于叢毛單胞菌對(duì)2-吡啶甲酸的降解目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

圖2　ZD3掃描電鏡照片　×10 000

圓括號(hào)表示序列號(hào);結(jié)點(diǎn)表示分類學(xué)單元;橫線長(zhǎng)度表示該分支的進(jìn)化距離;分支上的數(shù)值表示菌株間的相似性圖3　ZD3的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2　2-吡啶甲酸的降解

在好氧條件下,影響微生物降解性能的環(huán)境因子主要包括溫度、pH值、溶解氧濃度(由搖床轉(zhuǎn)速表示)和污染物初始濃度[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株ZD3的最適降解溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min,鹽度(NaCl含量)為0。本文重點(diǎn)研究pH和2-吡啶甲酸初始質(zhì)量濃度對(duì)2-吡啶甲酸微生物降解的影響。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示,2-吡啶甲酸的質(zhì)量濃度保持不變,說(shuō)明沒有出現(xiàn)非生物降解。

2.2.1pH值對(duì)降解的影響分別采用初始pH值調(diào)節(jié)法和緩沖溶液法研究培養(yǎng)液pH值對(duì)2-吡啶甲酸的影響。

(1)初始pH值調(diào)節(jié)法。初始pH值調(diào)節(jié)法指接種前在以2-吡啶甲酸(100 mg·L-1)為唯一碳、氮、能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入HCl或NaOH調(diào)節(jié)其初始pH值(4.0～10.0)。由表1可以看出,7.0為最適pH值,在此條件下12 h后2-吡啶甲酸降解率(D)幾乎達(dá)到100%,TOC分析顯示,此時(shí)2-吡啶甲酸完全礦化為二氧化碳和水。當(dāng)初始pH值為5.0和9.0時(shí),抑制作用出現(xiàn),2-吡啶甲酸完全去除的時(shí)間延長(zhǎng)至48 h。當(dāng)初始pH值為4.0和10.0時(shí),2-吡啶甲酸不發(fā)生降解。此外,當(dāng)初始pH值在5.0～9.0之間時(shí),降解過(guò)程中pH值上下波動(dòng),整體呈下降趨勢(shì),分析認(rèn)為可能是2-吡啶甲酸轉(zhuǎn)化為具有不同酸堿性的中間產(chǎn)物,從而造成了pH值的變化。

當(dāng)初始pH值為4.0和10.0時(shí),2-吡啶甲酸沒有發(fā)生降解,表明沒有其他中間產(chǎn)物生成,然而培養(yǎng)液的pH值卻發(fā)生了變化,并呈下降趨勢(shì)。分析原因可能是:2-吡啶甲酸色譜分析中的弱酸電離常數(shù)pKa1=1.0[16],根據(jù)亨德森-哈塞爾巴爾赫方程,在初始pH值分別為4.0和10.0的條件下,2-吡啶甲酸發(fā)生解離,吡啶環(huán)上的羧基釋放出質(zhì)子,從而導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值下降。

表1　　　　降解過(guò)程中pH值和2-吡啶甲酸降解率的變化

(2)緩沖溶液法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不宜采用有機(jī)緩沖液,這是由于其中所含的有機(jī)成分(如鄰苯二甲酸氫鉀)或可充當(dāng)菌株ZD3的碳源,從而會(huì)影響菌株ZD3對(duì)2-吡啶甲酸的利用,或是具有毒性(如六亞甲基四胺),從而抑制ZD3的活性,使得ZD3無(wú)法降解2-吡啶甲酸。因此,本文采用無(wú)機(jī)緩沖溶液。

圖4a顯示,在整個(gè)降解過(guò)程中pH值始終保持恒定。圖4b顯示:在pH=7.0的條件下,菌株ZD3對(duì)2-吡啶甲酸的降解性能最好,10 h內(nèi)降解率幾乎為100%;在pH值為5.0～9.0的條件下,2-吡啶甲酸也能完全降解,其中pH=6.0時(shí)降解速率最快,50 h左右可完全降解,而在pH=5.0和pH=9.0時(shí)降解速率略小,完全降解時(shí)間延長(zhǎng)至60 h;在pH為4.0、10.0和12.0的條件下,經(jīng)過(guò)120 h后2-吡啶甲酸的降解率均不超過(guò)10%,其中pH=4.0時(shí)2-吡啶甲酸的降解率最低,120 h后僅為1.8%;pH=10.0時(shí),120 h后的降解率為7%。按照降解率由高到低排序,所對(duì)應(yīng)的pH值順序依次為:7.0,6.0,5.0,9.0,10.0,12.0,4.0。初始pH值法和緩沖溶液法所得到的結(jié)果基本一致。

(a)降解過(guò)程中pH值的變化

(b)不同pH值下2-吡啶甲酸的降解率圖4　不同pH值緩沖溶液對(duì)2-吡啶甲酸降解的影響

2.2.22-吡啶甲酸初始濃度對(duì)降解的影響由圖5可知,當(dāng)2-吡啶甲酸初始質(zhì)量濃度ρ0(2-PA)分別為100、200、400、600和800 mg·L-1時(shí),菌株ZD3完全降解所需的時(shí)間分別為12、17、20、78和114 h,對(duì)應(yīng)的總有機(jī)碳去除率分別為99.5%、98.3%、99.2%、98.5%、97.8%。由此可見,隨著2-吡啶甲酸初始質(zhì)量濃度的增加,對(duì)降解的抑制作用逐步增強(qiáng),降解遲滯期也隨之延長(zhǎng)。

圖5　　　　菌株ZD3對(duì)不同初始質(zhì)量濃度2-吡啶甲酸的降解結(jié)果

圖6是初始質(zhì)量濃度為200 mg·L-1的2-吡啶甲酸溶液的好氧降解紫外光譜圖,從中可以看出:從0到11 h,A265峰的高度幾乎沒有發(fā)生變化,說(shuō)明2-吡啶甲酸(A265峰)的質(zhì)量濃度基本保持不變,而從12 h起,2-吡啶甲酸的質(zhì)量濃度開始降低(A265峰的強(qiáng)度開始減弱),并在A310峰處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰,表明2-吡啶甲酸已轉(zhuǎn)化為新的中間產(chǎn)物;從13到18 h,A265和A310峰的強(qiáng)度同時(shí)減弱直至消失。分別測(cè)試了0 h和18 h的總有機(jī)碳,顯示18 h后總有機(jī)碳去除率為99.03%,表明2-吡啶甲酸最終礦化為二氧化碳和水。當(dāng)2-吡啶甲酸的初始質(zhì)量濃度為100、400、600和800 mg·L-1時(shí),亦有同樣的現(xiàn)象。

(a)0～12 h

(b)13～18 h圖6　200 mg·L-1 2-吡啶甲酸溶液的好氧降解紫外光譜圖

圖7顯示了對(duì)應(yīng)圖6中13 h樣品的HPLC-IT-TOF-MS譜圖,圖中質(zhì)荷比m/z=138.023 3的譜線對(duì)應(yīng)6-羥基吡啶甲酸的[M-H]-加合物。通常2-吡啶甲酸生物降解的第一步反應(yīng)是在相鄰N原子的α碳上引入羥基,從而生成6-羥基吡啶甲酸[1-2,17],本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)的報(bào)道一致。關(guān)于菌株ZD3對(duì)2-吡啶甲酸的好氧生物降解途徑,目前還在進(jìn)一步研究中。

圖7　6-羥基吡啶甲酸的質(zhì)譜圖

2.2.3降解動(dòng)力學(xué)模型零級(jí)和一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型[18-19]分別為

ρ=a+k0t

(1)

lnρ=b+k1t

(2)

式中:a、b為常數(shù);t為降解時(shí)間;ρ為底物的質(zhì)量濃度;k0、k1分別為零級(jí)、一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。

對(duì)應(yīng)于圖5中的每一條降解曲線,在線性范圍內(nèi)分別使用零級(jí)動(dòng)力學(xué)和一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合(見圖8),發(fā)現(xiàn)零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2明顯高于一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的(見表2和表3),表明前者具有更好的擬合度,對(duì)應(yīng)的模型參數(shù)具有更高的準(zhǔn)確度。

表2　2-吡啶甲酸的零級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

表3　2-吡啶甲酸的一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

(a)零級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線

(b)一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線圖8　降解動(dòng)力學(xué)模型的擬合曲線

由表2可以看出,當(dāng)2-吡啶甲酸的初始質(zhì)量濃度范圍為100～400 mg·L-1時(shí),降解速率常數(shù)隨著初始質(zhì)量濃度的升高而增大,分析原因可能是該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的2-吡啶甲酸不能為菌株ZD3提供足夠的碳源、氮源和能源,底物濃度相對(duì)于菌株生長(zhǎng)處于非飽和狀態(tài),因此2-吡啶甲酸的初始質(zhì)量濃度越高,其降解速率就越快。當(dāng)2-吡啶甲酸的初始質(zhì)量濃度增加到600～800 mg·L-1時(shí),降解曲線仍然符合零級(jí)反應(yīng),但降解速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),底物抑制效應(yīng)出現(xiàn)。這一結(jié)果與宋秀蘭等人的報(bào)道[18]一致。

3　結(jié)　論

(1)分離篩選了一株在好氧條件下以2-吡啶甲酸為唯一碳、氮、能源的菌株,16S rRNA基因序列分析鑒定該菌株為叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)。

(2)考察了培養(yǎng)液pH值對(duì)2-吡啶甲酸降解性能的影響,最適pH值為7.0;隨著2-吡啶甲酸初始質(zhì)量濃度的提高,菌株完全降解2-吡啶甲酸的時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。

(3)建立了降解動(dòng)力學(xué)模型,零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型較一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能更好地?cái)M合初始質(zhì)量濃度范圍為100～800 mg·L-1的2-吡啶甲酸的降解曲線。當(dāng)2-吡啶甲酸初始質(zhì)量濃度為100～400 mg·L-1時(shí),降解速率常數(shù)隨著質(zhì)量濃度的升高而增大;當(dāng)2-吡啶甲酸的質(zhì)量濃度為600～800 mg·L-1時(shí),降解速率常數(shù)變小,底物抑制效應(yīng)出現(xiàn)。

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