羊源肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定

謝宇舟，吳翠蘭，李 軍，陶 立，李常挺，彭 昊，馬春霞，潘 艷

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧530001）

克雷伯氏菌屬為腸桿菌科的成員，有肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和土生克雷伯氏菌這4個種[1]。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一種條件性致病菌，可引起肺炎、子宮炎、腹瀉等疾病[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，由肺炎克雷伯氏菌引起的疾病致死率較高，它不僅給養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，也嚴重危害人類的健康。

2017年8月，我們對死亡黑山羊的檢測中分離到1株肺炎克雷伯氏菌，現(xiàn)將病原菌的主要特征報告如下。

1　材料與方法

1.1　病料

采集自廣西某山羊場病死羊的肺臟。

1.2　細菌分離

取病死羊的肺臟在無菌操作工作臺接種于麥康凱平板上，放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)24h后觀察細菌生長情況。然后挑取單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢和肉湯培養(yǎng)。

1.3　細菌生化試驗

將分離到的細菌接種于微量生化反應管，放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察細菌生長特性，在《臨床常見細菌、真菌鑒定手冊》[3]進行比對。

1.4　細菌16S rRNA基因測序和分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌的DNA，應用16S rRNA細菌鑒定引物進行PCR擴增，經(jīng)電泳、回收、克隆、測序。并對測序結果進行分析。

1.5　細菌致病性試驗

取12只健康小白鼠均分為兩組，每組各6只，分別為試驗組和對照組。試驗組小鼠的攻毒劑量為0.3mL/只（濃度為2×108 CFU/mL），對照組則注射等量的生理鹽水。然后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察小鼠的身體狀況。

1.6　藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散的方法進行藥敏試驗，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，按照該公司試驗標準進行操作，然后放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)12～24h后，觀察抑菌圈情況。

2　結果

2.1　細菌分離和鑒定

將肺組織劃線接種于麥康凱平板上，置于37℃培養(yǎng)24h后，菌生長良好，菌落顏色為紅色。菌落有點黏稠，挑取單個菌落時具有拉絲現(xiàn)象，經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性、短桿菌。

2.2　細菌生化鑒定

分離株的生化特性結果V-P試驗、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、尿素酶試驗均為陽性；吲哚、甲基紅和明膠水解試驗為陰性（表1）。該生化特性結果與《臨床常見細菌、真菌鑒定手冊》的克雷伯氏菌屬肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。

表1　藥敏試驗結果

2.3　分離菌16S rRNA擴增和測序分析

該分離株經(jīng)PCR擴增、電泳，得到了相應的目的片段（圖1）。將PCR擴增產(chǎn)物送測序公司進行測序。用生物學軟件對該分離株的測序結果進行分析，得到了長為1438 bp的片段，命名為GXSL。

圖1　分離株16S rRNA擴增電泳圖

用MegAlign對9株肺炎克雷伯氏菌參考株和GXSL分離株進行核苷酸同源性比較，結果GXSL與肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上（圖2）。

用MEGA7用MegAlign對9株肺炎克雷伯氏菌參考株和GXSL分離株進行核苷酸進化樹分析，該分離株與肺炎克雷伯氏菌在同一分支上（圖3）。

以上分析結果表明，獲得的GXSL分離株為肺炎克雷伯氏菌。

2.4　分離菌的致病性試驗

實驗組接種分離菌5h后開始表現(xiàn)為精神沉郁、不好動，24h內(nèi)小鼠死亡4只，在48h內(nèi)6只小鼠全部死亡，死亡率為100%，而對照組小鼠表現(xiàn)正常。將死亡小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)心和肺嚴重出血，肝有壞死點。將小鼠病變組織在麥康凱平板進行劃線、培養(yǎng)，回收到與接種菌一樣的細菌。

圖2　氨基酸同源性比較

圖3　核苷酸進化樹

2.5　藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示該菌對頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢曲松和鏈霉敏感，對強力霉素、慶大霉素、青霉素G、氧氟沙星、蒽諾沙星、卡那霉素、復方新諾明、諾氟沙星、阿奇霉素、多粘菌素B、利福平和環(huán)丙沙星這12種藥物耐藥（表2）。

表2　藥敏試驗結果

3　分析討論

近年來，肺炎克雷伯氏菌已成為危害人類和動物的重要條件致病性菌之一[4]。肺炎克雷伯氏菌首先是從病人的大葉性肺炎中分離到的；在動物界中，滕濤等[4]從團頭魴的潰瘍處和肝脾病灶部位、彭智偉等[5]從水貂肝臟病變組織、王孝友等[6]從兔的肺肝等病變組織、賀番等[7]從奶牛乳房炎中分離到肺炎克雷伯氏菌，這些研究表明，由肺炎克雷伯氏菌感染的動物逐漸增多，該病原已成為備受關注的人獸共患病病原。

本研究從病死羊的肺臟中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌。生化試驗鑒定結果V-P試驗、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、尿素酶試驗均為陽性；吲哚、甲基紅和明膠水解試驗為陰性。該菌的形態(tài)特征和生理生化特性均與肺炎克雷伯氏菌相符合，初步判定為肺炎克雷伯氏菌。

由于16S rRNA基因具有細菌屬、種的特征，現(xiàn)已被用來作為細菌鑒型的依據(jù)[1]。本研究對分離株GXSL和9株肺炎克雷伯氏菌參考株基于16S rRNA基因的核苷酸同源性比較和核苷酸進化樹分析，結果表明分離株GXSL與肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上；核苷酸進化樹分析顯示，該分離株與肺炎克雷伯氏菌在同一分支上，這更進一步說明該分離株為肺炎克雷伯氏菌。由此可見，對于細菌的分離鑒定我們需要借助于傳統(tǒng)的分離鑒定方法和新型的分子生物學方法相結合，所得的結果更加可靠。

肺炎克雷伯氏菌是致病性強的病原菌，陳興生等[8]從死牛體內(nèi)分離到毒力較強的肺炎克雷伯氏菌；馮娜等[9]報道接種肺炎克雷伯氏菌的小鼠在24h全部死亡。而本研究在致病性試驗中，該分離株也使小白鼠100%致死，并使小白鼠出現(xiàn)心和肺嚴重出血、肝有壞死點等癥狀，說明本試驗分離株GXSL的致病性也很強。由于肺炎克雷伯氏菌致病相關毒力因子比較多，因此，其毒力基因的確定還要待進一步的研究。

本試驗還對該菌進行藥物敏感性試驗，分離出4種較敏感的藥物：頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢曲松和鏈霉敏感，其余對強力霉素等12種藥物耐藥，這試驗結果與馮娜等[9]的報道結果基本一致。這種耐藥性的產(chǎn)生可能由于各種抗菌藥物的廣泛使用，加之，肺炎克雷伯氏菌可以產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶，從而導致耐藥性的普遍存在[10]。

本研究通過微生物學手段和分子生物學技術從病死羊的肺臟中分離鑒定出1株肺炎克雷伯氏菌，并成功篩選了幾種較敏感性藥物，為治療和預防該菌對羊的危害提供可靠的數(shù)據(jù)。

[1]房海，陳翠珍，張曉軍，等.羊肺炎克雷伯氏菌感染癥及病原菌檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國人獸共患病雜志，2005,21(10)：895-899.

[2]周玉龍，李國軍，李陽，等.奶牛肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].中國奶牛，2007,(6)：36-38.

[3]陳瑜.臨床常見細菌、真菌鑒定手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：68-69.

[4]滕濤，梁利國，謝駿，等.團頭魴源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].水生態(tài)學雜志，2016,37(6)：95-99.

[5]彭智偉，張長生，梁宇翔，等.水貂肝臟中肺炎克雷伯氏菌的鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(01)：148-149.

[6]王孝友，王永康，楊睿，等.兔肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].中國養(yǎng)兔，2011,4：10-18.

[7]賀番，賀瑜，孟寧生，等.奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)柯基信息，2015,11：19-21.

[8]陳興生，葉育桐.牛肺炎克雷伯氏菌的分離和鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1997,23(3)：13.

[9]馮娜，高翔，肖敏，等.牛源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及遺傳進化樹分析[J].中國獸醫(yī)科學，2016,46(11)：1358-1364.

[10]王召朋，柴同杰，牟特，等.青島地區(qū)兔肺炎克雷伯氏菌分離鑒定[J].山東畜牧獸醫(yī)，2012,33(5)：16-18.