水貂阿留申病膠體金免疫層析試紙條與對流免疫電泳對比試驗

劉 潔，李 偉，任二軍，劉進軍，韓學良

（石家莊市農林科學研究院，河北石家莊050041）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink，AD)又稱漿細胞增多癥，是由細小病毒科的水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起水貂的一種慢性、消耗性、免疫抑制性傳染病。成年水貂病理變化及臨床癥狀為高免疫球蛋白血癥、動脈炎及腎小球腎炎，水貂皮張質量及繁殖能力下降，容易繼發其他疾病，幼貂常發生急性間質性肺炎甚至死亡[1]。目前沒有有效的疫苗預防，也無特效藥治療，所以對貂群進行快速高效靈敏的檢測從而消除AD抗體陽性水貂就成了控制該病最有效的方法。目前國內外研究出診斷AD檢測方法主要有碘凝集實驗、對流免疫電泳（Counter Immunoelectrophoresis,CEP）、基因芯片法、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、膠體金免疫層析試紙條(gold immunochromatography assay,GICA)、熒光定量PCR法等。本試驗利用GICA和CEP兩種方法對河北某貂場隨機采取的血清樣本進行檢測，并對二者的符合情況及檢測成本進行比較。

1　材料

1.1　試驗動物

隨機選取河北某貂場籠養水貂192只。

1.2　儀器

電泳槽及電泳儀（北京六一廠）、微波爐、電子天平、移液器（eppendorf），打孔器、砂輪、注射器針頭、玻璃板（10cm×10cm×1mm）、100ml錐形瓶、肝素鈉抗凝毛細采血管(20ul)、毛細管盒、工業橡皮泥、剪指刀。

1.3　試劑

CEP診斷抗原和陽性血清來自丹麥進口分裝；電泳緩沖液（Tris base 2.408g，巴比妥鈉 4.064g，巴比妥 1.024g，溶于 500mL蒸餾水，用濃鹽酸調節pH至8.4-8.6）；1.0%瓊脂糖凝膠；ADV抗體膠體金快速檢測試紙條（貨號：9903）由北京納百景奕（NBGen）生物科技有限公司提供。

2　方法

2.1　血樣采集

一人保定水貂，一人用剪指刀剪掉水貂趾甲，用毛細采血管采血，虹吸至2/3處，用工業橡皮泥封口，放入毛細管盒，并做好標記。常溫或4℃冰箱過夜放置自然分離血清。

2.2　試紙條檢測

2.2.1　樣品準備

將采血梳用記號筆編號，寫清籠舍號，采血后，按標記順序粘貼在標記好的采血梳粘性凹槽內，并對齊下沿，以便后期操作。

2.2.2　操作步驟

根據待檢樣本數量，取出足量的反應微孔，將其放置于微孔架上備用；用滴管向微孔中加入標記刻度量的ADV快速檢測稀釋液 （約100ul），將下端對齊的采血梳按標記順序插入反應微孔，可稍微晃動，以保證血樣充分溶解；浸泡兩分鐘后，取出采血梳；插入待檢試紙條，計時5min；用剪刀剪掉吸水端，終止反應。

2.2.3　結果判定

質控線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色，結果為陰性；質控線（C線）顯色，檢測線（T線）也顯色，結果為陽性。

2.3　對流免疫電泳檢測

實驗方法步驟及結果判定參考本課題組之前發表文章[2]。

3　結果

CEP和GICA兩種檢測方法的陽性檢出率見表1，符合率見表2。從表1可以看出，GICA的檢出率為57.81%，CEP檢出率為56.25%，GICA的檢出率比CEP高1.56%。從表2可以看出，CEP陽性的GICA檢測全部為陽性，CEP陰性、GICA陽性的為3只，不符合的數量為3只，GICA和CEP檢出都為陽性的108只，都為陰性的81只，符合數是189只，符合率是98.44%。

表1　對流免疫電泳與試紙條的陽性檢出率

表2　對流免疫電泳與試紙條的符合率

4　討論

1972-1974年Cho等在加拿大首次應用CEP診斷AD，該方法原理是利用ADV抗體（被檢水貂血清）和抗原（臟器或細胞抗原）在電場作用下進行反應，抗原由陰極向陽極移動，而抗體則由陽極向陰極運動，二者在兩孔之間接觸，在瓊脂凝膠中形成肉眼可見的灰白色沉淀線[3]。CEP法重復性好，與病理剖檢結果的符合率達到100%；特異性強，達到97%；特異性高則敏感性低，敏感性僅75%，因此當水貂在感染ADV初期或轉歸期時由于抗體水平較低則可能出現假陰性結果，這也是每年在11月份左右只檢疫1次而不能檢測出所有陽性水貂的重要原因[4]。在AD的各種診斷方法中，CEP是世界公認的并且應用最為廣泛的。但該法仍存在一些弊端，結果判定的誤差較大，抗原多是細胞抗原或臟器抗原等全病毒抗原，存在著散毒的危險，耗時較長，需要特殊儀器設備和較高的技術支持，不適合于現場診斷。GICA是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細管作用原理，以膠體金為標記物來顯示結果的一種新型的檢測技術[5]。該方法操作簡便、快捷，一般只要5～10min便可得到檢測結果，且需要血量少，只需一滴血即可，減少了感染的機會。結果清楚、易于判斷、誤差小，不需要任何儀器、成本低廉，對操作人員技術要求不高，不受外界環境的影響等，非常適用于現場及自動化檢測，缺點是由于采血后需要按標記順序將采血紙粘貼在標記好的采血梳凹槽內，且檢測試劑試紙條取出后應盡快使用，必須同時采血同時檢測，增加現場工作勞動量。

本研究共檢測水貂血清樣品192個，采用GICA和CEP進行檢測，結果GICA的陽性檢出率為57.81%，CEP檢出率為56.25%，二者符合率是98.44%。CEP檢測陽性的GICA檢測全部為陽性，CEP陰性、GICA陽性的為3只，不符合的數量為3只，而在檢測中發現不符合的這3份血清T線顯色條帶相對較淺，推測可能是由于血清中AD抗體含量較低，而GICA敏感性比CEP相對較高，造成CEP未檢出。徐磊等用PBS對AD陽性血清進行倍比稀釋，用GICA分別進行檢測，結果當血清稀釋倍數至8倍時，仍能用GICA檢測出，而傳統的CEP法在血清稀釋到4倍就不能檢出，推測GICA的敏感性是CEP的至少2倍。他們同時用GICA和CEP分別檢測了45只水貂，結果GICA陽性率為71.1%，CEP陽性率為62.2%，說明GICA法檢出率較高，敏感性較好[6]。在檢測成本方面，CEP法1只份抗原成本為2.00元，加上凝膠、緩沖液、陽性血清等每只的檢測成本至少為2.50元，而GICA一只份成本也在2.50元左右，成本相當。

5　結論

膠體金免疫層析試紙條檢測阿留申病有快速、簡單、敏感性高、特異性強等優點，檢測成本和對流免疫相當，還可進行現場檢測，可以代替對流免疫電泳檢測方法。

[1]閆喜軍,肖家美,籍玉林.我國水貂阿留申病流行現狀、特點及防治技術[J].特種經濟動植物,2004,(05)：44.

[2]任二軍,劉潔,劉進軍,等.水貂阿留申病碘凝集與對流免疫電泳檢測方法比較[J].經濟動物學報,2017,(3)：134-136.

[3]Cho Hj Fau-Ingram D G,Ingram D G.Antigen and antibody in Aleutian disease in mink.II.The reaction of antibody with the Aleutian disease agent using immunodiffusion and immunoelectroosmophoresis[J].(0008-4050(Print)).

[4]于凱,倪佳,馮二凱,等.水貂阿留申病診斷抗原研究概述[J].動物醫學進展,2017,(4)：116-119.

[5]莊金秋,梅建國,沈志強.膠體金免疫層析技術在獸醫臨床診斷中的應用進展[J].中國動物檢疫,2012,(9)：70-75.

[6]徐磊.水貂阿留申膠體金免疫層析診斷方法的初步建立[D].City：中國農業科學院,2010.