肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變的檢測及其臨床意義

董一鳴

（濰坊市人民醫院，山東濰坊 261041）

目前，肺癌患者的數量持續增加，肺癌死亡的人數也在逐年攀升，已成為我國目前發病率和死亡率最高的疾病之一，嚴重地威脅了我國居民的健康和生命。在肺癌患者當中，非小細胞肺癌（NSCLC）比例70%～80%，現有的研究發現，在這些細胞當中，NSCLC的變異率十分高，加快了癌細胞的轉移和擴散。因此，對NSCLC進行基因突變檢測具有很強的現實意義，能夠對肺癌患者的治療起到很大的作用。與傳統的EGFR基因檢測相比，這種被稱為“液體活檢”的新型檢測技術，能夠最大限度的排除外界環境的干擾，減少外界細菌的侵入等等，能夠使得檢測結果更加的準確，而且能夠進行多次重復的利用，由于新型檢測方法的優越性，受到了醫學界人士的廣泛借鑒與運用[1]。

1 循環腫瘤癌細胞與肺腺癌的關系

1.1 CTCs可以用于癌癥早期判斷

腫瘤細胞是隨著時間的推遲，不斷擴散和增多。在時間的推移當中，一部分細胞的上皮組織出現了變異和轉化。這時，腫瘤細胞運動能力就會增強，吸附能力就會減弱，腫瘤細胞的攻擊性會逐漸增強，向身體其他部位擴散。進入血循環的CTCs具有較強的異質性，會受到自身免疫系統的攻擊，僅有少部分的細胞可以存活。因此，如果在患者的其他血液當中進行檢測到了CTCs細胞，就可以初步對肺癌進行診斷。因此，對于CTCs的單細胞的EGFR基因突變檢測，能夠及時發現肺癌患者，在早期進行治療，減少死亡率。

1.2 CTCs與肺癌分期的關系

目前，在臨床上采用的肺癌的劃分標準是依據美國的癌癥聯合委員會提出的TNM分期系統。美國的癌癥委員會的分期主要依據的是手術中的所見和影像學的檢測。但是，對于已經進入晚期的肺癌患者，單純的影像技術已經不能準確的反映癌細胞在患者體內的擴散情況，因為在長期的細胞變異過程中，癌細胞的表現形式并不單一。有研究表明，肺癌的CTCs和肺癌的分期具有很大的關聯性。在研究的過程當中，研究人員還選取了177名身體健康的志愿者進行相關的檢測，然后對CTCs細胞進行EGFR基因突變檢測。最終檢測的結果顯示，手術分期pT1/pT2，pT3，pT4患者CTCs檢測陽性率分別是5.6%、11.3%、83%，組間比較差異有統計學意義（P=0.001）。臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTCs陽性率分別是15.4%、29.7%、47.9%、75.0%，組間比較差異有統計學意義（P＜0.001）。這些研究的結果和數據都說明了CTCS和癌癥分期的關聯性，因此，我們在對肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變進行檢測時，能夠初步判斷該患者患病的時間和治愈的可能性，并且可以根據癌癥的分期，來選取最適當的治療方法，使得患者能夠得到最好的治療[2]。

2 肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變檢測的步驟

2.1 選取實驗的材料

本次試驗，我們向中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提出了申請，提取了研究院的3種非小細胞肺癌，它們的型號分別是AS49、NCI-H1650和NCI-H1975，之所以選取研究院的材料，主要是由于研究院在進行細胞的培養時，選用的是90% RPM1-1640培養基，并且添加了10%的優質血清，使得細胞更加的純凈，能夠使得研究檢測的數據更加的準確。這3種細胞各有各的特點，AS49主要攜帶的病菌是KRAS，但是KRAS與EGFR之間互相排斥，不能共融，所以，在進行基因突變的檢測過程當中，可以將KRAS作為陰性對照，而NC1-H1650攜帶EGFR外顯子19缺失突變，C1-H1975攜帶外顯子20（T790M）和21（L858R ）雙突變。

2.2 循環腫瘤細胞的捕獲方法及釋放

在進行本次試驗時，我們對于循環腫瘤細胞的捕獲主要是采用微流控系統將血液當中的CTCs與其它細胞分離出來，這種分離技術高效并且分離的細胞非常干凈。在運用微流控系統對CTCs進行捕獲的時候，要用UV光線對細胞進行照射，因為光線的照射可以對多聚和稀酸當中的光敏基因進行切割，從而使得CTCs能夠得到徹底的釋放。單細胞由于其體積十分小，在進行試驗操作的過程當中，十分容易丟失，這時就需要將捕捉到的CTCs細胞固定在試劑盒內，在進行顯微鏡觀察時，選用微型操作臺，在進行CTCs細胞的取用時，可以利用毛細玻璃管的負壓作用進行吸取，在轉移的過程也要注意防止細胞的掉落和混亂。在觀察完成之后，可以進行拍照記錄，然后將細胞快速的放回試劑盒當中。

3 EGFR基因突變的特征及檢測方法

3.1 EGFR的基因突變的生物特征

EGFR（epidermal growth factor receptor）是 表 皮 生長因子受體的組成部分之一，主要用于肺癌患者的檢驗。EGFR的突變主要表現在細胞內的18-21的外顯子上，異常的EGFR突變會導致腫瘤細胞的擴散、繁殖和分化。EGFR導致癌癥主要是通過3種形式，分別是EGFR的擴散、EGFR的活化和EGFR的配體過程。EGFR的檢測是目前在醫學界普遍被接受的一種腫瘤靶向治療分子，與傳統的癌癥治療方法相比，EGFR基因突變檢測的方法能夠使得患者得到更加準確、及時的治療。

3.2 EGFR基因突變的檢測方法

EGFR基因突變檢測的方法主要分為3種：測序法、聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性分析法和突變體富集檢測法。DNA的測序法是目前用于EGFR基因突變檢測最可靠和運用范圍最廣的一種方法。但是這種方法耗時長、費用高和技術要求高，在國內的專業的檢測機構較少。所以在進行EGFR基因突變檢測時，往往是根據癌癥分期，來選用不同的檢測方法。

4 單細胞EGFR基因突變檢測對于臨床的意義

4.1 提高檢測結果的準確性

由于目前科技水平的限制，對于癌癥的治療效果的判斷只能依靠影像學的技術，根據治療的情況，也將治療效果劃分為了4個等級：完全緩解、部分緩解、穩定、病情進展。但是影像學的局限性十分明顯，只能顯示宏觀的變化，例如細胞的運動和擴散情況，患者的身體變化等等，但是對于微細胞的轉移卻不能反映。這時，就不得不發明一種新的檢測方法，使得一切細胞的轉移和擴散都在檢測范圍之下。研究顯示，肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變檢測結果對于肺癌患者的治療情況仍然具有很強的參考意義[3-5]。對CTCs細胞的數量、分布情況和轉移趨勢等方面的研究，可以實現對患者總體身體狀況的判斷，也可以更加準確的知道癌細胞在患者體內的具體情況。而且和傳統的檢測方法比較，對CTCs細胞進行EGFR基因檢測的方式，不僅可以使得檢測結果更加準確，還使得檢測更加簡便高效。

4.2 保證治療時間的及時性

對于肺腺癌循環腫瘤細胞的EGFR的基因檢測，可以對肺腺癌的情況做到精準的判斷。通過對于腫瘤細胞數量和分布情況和增長速度的限制等等，可以對患者的病情做出斷定，然后依據病情，對患者進行及時準確的治療。

4.3 減少對于患者的傷害，提高康復率

EGFR是國際上普遍被認可的一種治療腫瘤的方法，使用范圍非常的廣，EGFR的治療方法可以運用到多種領域，這種方法對于患者產生的傷害更小，與傳統的治療癌癥的方法有著明顯的不同，可以最大限度的減少化療等手段給患者帶來的毒副作用。更為重要的一點是，選用EGFR腫瘤靶向治療的方法，能夠在治療的過程當中，通過對于患者體內CTCs細胞的監控，實時對患者的治療情況進行跟進，能夠減少癌癥患者病情惡化的情況，而且能夠在一定程度上提高肺腺癌患者的痊愈率和康復率[6]。

5 單細胞EGFR基因突變檢測問題與展望

世界范圍內的肺癌患者越來越多，除了吸煙造成的肺癌之外，空氣質量下降、不知名氣體的泄露或者二手煙的危害、化學氣體的危害等等也會導致肺癌的產生。目前，肺癌的治療效果并不明顯，而且治療的效果也比較差。所以，對肺癌的關注也逐漸增高，對肺癌治療方法的關注度也顯著提高。因此，國內外的專家學者和臨床的醫護人員，對于CTCs的研究也投入了大量的時間和精力，主要是由于CTCs細胞與肺癌之間有極大相關性。目前的檢測手法和臨床試驗與治療都存在著一些問題，例如臨床的實驗不足，檢測的方法和手段不夠準確科學，缺乏統一的標準等等[7]。相信隨著科技的發展和人們重視程度的提高，對于肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變檢測一定會更加的準確。

6 結語

肺癌的問題在全球范圍內都受到了廣泛的重視。對于肺腺癌循環腫瘤細胞的單細胞EGFR基因突變的檢測十分有必要，特別是CTCs細胞與肺癌具有強大的相關性[8]。近些年來，隨著研究的不斷深入單細胞的EGFR基因的突變檢測已經取得了很大的進展，這些進展對于肺癌患者的臨床治療具有很強的指導意義。