淺析基因檢測技術

劉 燕 許友強 周婷婷 劉明珠 李雨艷

（吉林金域醫學檢驗所有限公司實驗診斷部，吉林長春 130000）

在眾多基因檢測技術中，測序技術無疑是最為直觀、準確的方法之一，并且隨著基因檢測在醫學檢驗中的不斷應用發展，其檢測技術也在不斷進步，從第1代測序技術至今已經發展到了第4代測序技術[1]。本文旨在對基因檢測技術的發展歷程及4代測序技術的基本原理和醫學應用進行淺析。

1 第1代測序技術

目前為止，第1代測序技術是指由Sanger于1977年發明的雙脫氧末端終止法測序，也稱Sanger測序。其基本原理是，用放射性同位素標記的引物進行PCR擴增反應，引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），它與普通的脫氧核苷酸（dNTP）不同，不能合成磷酸二酯鍵，迫使DNA鏈立即停止延長，其合成反應也將終止，通過調節ddNTP 和dNTP的比值可以得到不同長度的片段，最后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對合成的各個大小的片段進行分離，得到整個片段的序列信息。到了20世紀80年代，用熒光標記代替放射性同位素標記，發展為熒光自動測序技術，到了20 世紀90 年代，毛細管電泳技術和微陣列毛細管電泳技術發展迅速，出現了帶有熒光標記的毛細管電泳測序方法，使得測序技術在效率和安全性上有了顯著的提高。

2 第2代測序技術

第2代測序技術亦稱下代測序技術，可以同時將幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序，全面細致的對基因組進行測序，因此又叫深度測序，與第1代測序技術相比是一場劃時代的變革[2]。第2代測序技術主要采用邊合成邊測序的基本原理，可以在測序反應正在反應的同時收集測序信號，主要是將基因組DNA片段連接上通用接頭，然后進行擴增反應合成大量的多克隆序列，進而平行測序，經生物信息學技術計算后獲得完整的序列信息，并進行數據分析，鑒定是否存在基因突變，SNP 位點等，從而診斷相應的疾病。

第2代測序技術和第1代測序技術相較，具有通量高，自動化程度高，測序速度高，成本低等優勢，是迄今為止應用最為廣泛的一類測序技術。其在臨床診療方面的應用也非常廣泛，檢測基因突變可用于腫瘤的診斷（肺癌基因熱點突變和融合檢測、實體腫瘤關鍵基因熱點突變和融合檢測、結直腸癌/肺癌組織樣本中突變熱點檢測等）；遺傳性疾病篩查（線粒體疾病、遺傳性耳聾及神經肌肉障礙等）；染色體非整倍體無創產前篩查：胎兒的染色體異常遺傳病中最主要的就是染色體非整倍體，其中以21三體（唐氏綜合征）、18三體（愛德華氏綜合征）和13三體（Patau綜合征）為主要形式，現階段的醫療水平對于非整倍性染色體病并沒有可靠的治療方案，唯一有效地方法就是對孕婦進行產前篩查與診斷；在胚胎植入母體前進行遺傳學的篩查等[3]。經過了幾十年的探索和研究，第2代測序技術在臨床的應用已經十分成熟。

3 第3代測序技術

第3代基因測序技術主要是以單個分子讀取技術為原理。包括單分子實時測序技術、離子半導體測序技術、HeliScope單分子測序等技術[4]。其中最成熟的為SMRT技術，該技術的核心是采用零級波導技術檢測單分子熒光信號。熒光標記的dNTP與模板結合形成磷酸二酯鍵，3’端標記上熒光基團，在DNA 聚合酶的作用下被切去，其熒光信號經ZMW檢測，ZMW 芯片上有許多小孔，直徑只有數十納米，遠短于激光的波長，使激光無法穿過小孔，并在光線照射時呈現指數衰減的消逝波，但可以將激發的小于波長的熒光局限在小孔內，且DNA 聚合酶結合在小孔內進而形成一個檢測的空間，檢測激發的熒光信號，只有靠近基質的熒光信號會被保留，消除背景熒光的干擾，根據得到的熒光信號光譜來區分不同堿基，進而得到DNA 序列。

第3代測序技術在第2代測序技術基礎上增加了讀長，而且不經PCR技術進行DNA擴增，直接進行邊合成邊測序，因此縮短了測序時間，降低了試劑成本，而且不受胞嘧啶和鳥嘌呤含量的影響。第3代測序技術的讀長優勢可彌補第2代測序技術的不足，其在臨床上可以用于病毒基因組的研究，對經病毒侵染的疾病在治療中具有重要意義；與第1、第2代測序技術相比，在某些醫學領域中有著廣泛的應用，如對遺傳學領域中SNP位點檢測及甲基化識別具有很高的分辨率；在RNA的檢測方面也有廣泛應用，對于在21三體綜合征的檢測中具有重大意義，根據第3代測序技術的miRNA測定可以提高診斷的正確率。

4 第4代測序技術

第4代測序技術也可稱為納米孔的單分子測序技術，該技術主要是采用電信號原理進行序列測定的，用于DNA測序的納米孔有生物的納米孔以及固態的納米孔兩種，生物納米孔，又叫跨膜蛋白通道，有α-溶血素納米孔和蛋白納米孔，固態納米孔有石墨烯納米孔、聚合物膜和其他混合材料。第4代測序技術利用不同堿基具有不同的電學性質，通過納米孔直接對堿基穿過電極時的電信號進行測量，進而識別堿基的排列順序。原理主要為DNA一端與特殊的蛋白相連，使DNA 的正義鏈和反義鏈先后通過納米孔，由于ATCG 這4 種堿基電學性質不同，穿過納米孔的時候電流變化量也不同，通過對電信號的改變進行解析，得到DNA序列。

第4代測序技術是一類測序的新方法，將電子傳導的技術與單分子的檢測技術相結合，摒棄了PCR 擴增和洗脫DNA的過程，盡可能規避了在實驗過程中造成的誤差，并且具有更高通量、更長讀長、更短測序時間、更低成本和更簡單的數據分析等優勢[5-6]。在應用方面，第4代測序技術可以用于RNA 測序、檢測單鏈及雙鏈DNA片段、重復序列及Poly 結構的測定、蛋白質的檢測等，在臨床和醫學方面，特別是在癌癥上的研究起著領頭羊的作用。

5 結語

第1代測序技術仍然是基因檢測的金標準，但其通量低，測序成本高，對于檢測單基因的突變以及通量較少的測序是最優的選擇。第2代測序技術發展成熟，通量高及成本低，但其主要的弊端是測序長度相對較短。第3代測序技術采取單分子的讀取技術，比第2代測序的數據讀取速度更加迅速，而且在第2代測序基礎上提高了讀長，但隨之帶來的是測序的數據準確性不高。第4代測序技術與前3代測序技術比較，采用納米孔電子傳導技術進行堿基檢測，可以避免在洗脫和擴增的過程中造成的誤差，在成本、速度和通量等方面有了顯著的提高，但其仍面臨很多挑戰，處于發展中的狀態[7]。

總之，不同的測序技術有各自的優缺點，也為臨床檢測提供了更多更方便的選擇，促進了臨床醫學的進步，有理由相信，基因測序技術在未來的醫學檢驗更加發光發熱。