EPCR對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移的影響及機制

徐炎炎,卓倩，湯洋洋，王慶苓

(徐州醫(yī)科大學，江蘇徐州 221004)

內皮細胞蛋白C受體(EPCR)是一種血管內皮細胞上表達的I型跨膜糖蛋白[1]。最初研究認為EPCR主要定位于大血管的內皮細胞上，在多數(shù)組織的微血管內皮中表達極低或不存在，還特異性表達于人支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、單核細胞及中性粒細胞。EPCR是蛋白C(PC)和活化蛋白C(APC)的細胞受體，EPCR能與PC特異性結合，使PC活化效率提高4～20倍，APC繼而活化蛋白酶激活受體1(PAR-1)，且APC與其輔因子蛋白S一起降解凝血因子Va和Ⅷa，從而干擾凝血酶產生并抑制凝血級聯(lián)反應[1～7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)EPCR在部分腫瘤組織及細胞中表達[8]。EPCR在腫瘤細胞中的作用復雜，大部分研究認為EPCR促進腫瘤的生長，但亦有極少部分研究結果相反。另外EPCR在乳腺癌進展中的作用尚未闡明。2016年9月，我們探討EPCR在乳腺癌MBA-MB-231細胞增殖、遷移中的作用及分子機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學院細胞所，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學，Transwell 小室購自Millipore公司，Lipofectamine2000轉染試劑、opti-MEM和 EPCR siRNA片段GCACUCG-GUAUGAACUGCGGGAAU及無關序列對照購自Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司， 鼠抗人EPCR單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人Erk1/2單克隆抗體、兔抗人p-Erk1/2單克隆抗體、兔抗人AKT、兔抗人p-AKT(S473)、兔抗人p-AKT(T308)購自Cell signaling，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG隆抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgG隆抗體購自中杉金橋公司?？刮戳呀庑蚉AR-1抗體委托Abgent Biotechnology公司設計并制備。

1.2細胞培養(yǎng)、轉染及抗體阻斷處理 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)MDA-MB-231細胞。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細胞懸浮液培養(yǎng)過夜。將MDA-MB-231分為EPCR轉染組、無關序列轉染組和對照組，每組3個孔。分別加入5 μL/孔EPCR-siRNA、5 μL/孔 siRNA-NC、5 μL/孔空脂質體轉染,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，更換細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至實驗所需時間。同樣，將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細胞懸浮液培養(yǎng)過夜。將MDA-MB-231分為抗體處理組與對照組，每組3個孔。一組加入10 μg Anti-PAR1 抗體，一組為空白對照組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，更換細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至實驗所需時間。

1.3細胞中PAR-1蛋白表達檢測采用Western blotting法。提取各組細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗體EPCR(1∶1 000)、PAR-1(1∶1 000)、p-Erk1/2(1∶2 000)、p-Erk1/2(1∶2 000)、Akt(1∶1 500)、p-Akt(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4 ℃過夜。二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光檢測目的條帶，并采用Image J圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

1.4細胞增殖能力檢測將成功轉染或抗體處理24 h后的細胞，調整濃度為3.0×103/mL。按每孔100 μL接種細胞懸液至96孔板，每組設6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，將DMEM和CCK-8按10∶1的比例預先混勻，每孔加入100 μL，另設一個空白對照孔，無細胞生長孔，只加100 μL混合液，于37 ℃孵育2 h，酶標儀450 nm處檢測光密度值(OD值)。

1.5細胞遷移能力檢測將成功轉染或抗體處理24 h后的細胞，調整密度為1×104/孔，接種于Transwell小室的上室。每孔下室內加入完全培養(yǎng)液600 μL，將其放于24孔板上，每組設3個復孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，甲醇固定30 min，晾干后于1%結晶紫染液染色25 min，PBS洗滌后用棉簽輕輕擦去上室細胞。倒置顯微鏡拍照計數(shù)(×200)，每個小室隨機取10個視野，計算穿至小室膜下的細胞數(shù)后統(tǒng)計分析。

1.6MDA-MB-231細胞表面未裂解活化的PAR-1檢測采用Cell-ELISA法。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細胞懸浮液培養(yǎng)過夜。將MDA-MB-231分為EPCR轉染組、無關序列轉染組、空白對照組、陽性對照組。分別加入5 μL/孔EPCR-siRNA、5 μL/孔 siRNA-NC、5 μL/孔空脂質體轉染、5 μL/孔凝血酶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。調整細胞密度至3×104細胞/mL，將細胞接種于96孔板，每組設6個復孔，培養(yǎng)過夜。PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 mim。1%BSA室溫封閉1 h后加入一抗37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，加入二抗室溫孵育1 h。加入TMB顯色液顯色20 min后加入終止液終止反應。酶標儀450 nm處測OD值統(tǒng)計結果。

1.7干擾EPCR表達或添加抗PAR-1抗體對MDA-MB-231細胞Erk1/2和AKT 蛋白磷酸化水平的影響將無關序列和EPCR siRNA轉染，或用抗PAR-1抗體處理MDA-MB-231細胞，作用48 h后收集蛋白，然后采用Western blotting法分別檢測細胞中Erk1/2、p-AKT(S473)和p-AKT(T308)蛋白磷酸化情況。

2　結果

2.1干擾MDA-MB-231細胞中EPCR表達對PAR-1蛋白表達及活性的影響EPCR siRNA干擾MDA-MB-231細胞EPCR基因表達后，EPCR蛋白表達明顯降低，而細胞表面PAR-1的表達無明顯改變(圖1)。干擾EPCR表達后PAR-1的裂解活化受到抑制，空白對照組、對照組、抗體處理組細胞表面未裂解型PAR-1抗體結合率分別為0.98±0.069、0.54±0.066、1.79±0.175，抗體處理組細胞表面未裂解型PAR-1抗體結合率高于其他組(P均<0.05)。

圖1　　　　干擾EPCR表達后MDA-MB-231細胞中PAR-1蛋白表達

2.2干擾MDA-MB-231細胞EPCR表達對細胞增殖及遷移的影響 隨時間延長，OD值逐漸增高；在48、72 h EPCR轉染組細胞OD450值(0.86±0.133、1.05±0.041)低于無關序列組(1.35±0.131、1.70±0.073)及空白對照組(1.37±0.045、1.69±0.054)，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；而在相同時點內無關序列轉染組與空白對照組相比，OD450值無統(tǒng)計學差異，見圖2。Transwell實驗結果表明，EPCR轉染組穿過PET膜上8 μm小孔的細胞數(shù)量(71.4±10.986)較無關序列轉染組(202.50±11.316)與對照組(204.80±10.982)相比均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而無關序列轉染組與對照組相比無統(tǒng)計學差異。

2.3抗體阻斷PAR-1后對 MDA-MB-231細胞增殖及遷移的影響在48、72 h PAR-1抗體處理組的細胞OD450值(0.39±0.021、0.81±0.101)低于對照組(0.49±0.015、1.08±0.081)，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3。Transwell實驗結果顯示，與對照組(200.80±12.035)相比，抗PAR-1抗體處理組穿過PET膜上8 μm小孔的細胞數(shù)目(85.10±11.080)減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2　　　　干擾MDA-MB-231細胞EPCR表達對細胞增殖的影響

圖3　　　　抗體阻斷PAR-1后對 MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.4干擾EPCR表達或添加抗PAR-1抗體對MDA-MB-231細胞Erk1/2和AKT 蛋白磷酸化水平的影響干擾EPCR表達后或PAR-1抗體處理后，MDA-MB-231細胞中p-AKT(s473)蛋白磷酸化水平分別為0.30±0.052、0.31±0.012，p-AKT(T308)蛋白磷酸化水平分別為0.39±0.064、0.43±0.052，均低于對照組(0.75±0.029、0.71±0.023；0.90±0.03、0.86±0.08)，差異有統(tǒng)計學意義；而Erk1/2蛋白磷酸化水平分別為0.91±0.058、0.91±0.032；0.93±0.039、0.93±0.041，與對照組比較無統(tǒng)計學差異。

3　討論

惡性腫瘤的高致死率與腫瘤細胞的無限制生長，凋亡抗性和重要臟器的轉移有關。因而研究如何抑制腫瘤細胞增殖、遷移和促進凋亡將是治療腫瘤的一種新方法。以阻斷腫瘤細胞的增長和遷移并促進腫瘤細胞的凋亡為治療靶點，從而達到治療腫瘤的目的。腫瘤的發(fā)生發(fā)展受多種因子的調控，其發(fā)病機制復雜，深入研究腫瘤的發(fā)生機制可為臨床預防和治療腫瘤提供幫助。

EPCR是天然抗凝途徑的一個新成員蛋白，有諸多病理生理作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，EPCR在多種惡性腫瘤細胞中呈不同水平表達，且與腫瘤預后有關。研究報道腫瘤細胞中EPCR介導的細胞信號傳導可促進癌細胞遷移、侵襲和血管生成并抑制癌細胞凋亡[9,10]。體內實驗發(fā)現(xiàn)，沉默EPCR基因表達或阻斷EPCR-APC結合可減少肺癌細胞在靶器官的浸潤[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾人乳腺癌細胞EPCR基因表達之后，細胞的增殖及遷移能力均降低。提示EPCR在乳腺癌中的表達與乳腺癌細胞的生長與轉移可能有關，與報道一致。然而，亦有相反的結論。如EPCR被發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌介導敗血癥的預防中發(fā)揮重要作用[11]。

蛋白酶活化受體1(PAR-1)是目前PAR家族中研究最多亦是最為重要的成員。研究報道，PAR-1促進轉化和腫瘤細胞侵襲和轉移，與肺癌、胰腺癌的預后差有關[12,13]。另有研究報道PAR-1促進胃癌細胞的形態(tài)學改變并與細胞運動和侵襲相關[14]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾EPCR基因表達，可降低細胞表面PAR-1裂解活化水平，提示PAR-1的活性可受到EPCR表達改變的影響，且添加抗PAR-1抗體阻斷PAR-1作用可抑制MDA-MB-231細胞增殖及遷移，說明PAR-1可促進人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖及遷移。

MAPK/ERK和PI3K/AKT通路是細胞內重要的促增殖通路。Althawadi等[15]研究證實了在卵巢癌細胞系OVCAR-3中，游離的APC與膜型EPCR結合可通過MEK-ERK和Rho-GTP酶途徑誘導細胞遷移。Nguyen等[16]曾報道，APC在EPCR介導下通過P13K的磷酸化激活內皮型一氧化氮合酶，從而啟動有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化，引起相應的炎性因子及黏附分子表達上調。本研究干擾EPCR基因表達或添加抗PAR-1抗體阻斷PAR-1作用后，MDA-MB-231細胞中pAKT(s473)和pAKT(T308)磷酸化水平明顯降低，但Erk1/2磷酸化水平無明顯改變。本實驗結果提示MDA-MB-231細胞中的EPCR和PAR-1可能通過活化人乳腺癌細胞的Erk1/2通路促進人乳腺癌細胞的增殖及遷移。

綜上所述，EPCR可促進人乳腺癌細胞的增殖和遷移，其機制可能是通過激活PAR-1，從而激活Akt信號途徑。

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