CAR-T細胞制備過程中磁珠法激活T細胞條件的優化

張章，邱順芳，2，王瀟霖，丁乾，王晶，于長明，徐俊杰，張曉鵬

1.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071；2.安徽大學 健康科學學院，安徽 合肥230000

近年來，隨著生物技術的不斷發展，腫瘤免疫治療技術也取得了質的飛躍。尤其隨著針對免疫檢查點（CTLA-4 抗原和PD-1 抗原）單抗藥物[1]的問世，以及特異性靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾的T細胞免疫治療的崛起[2-3]，免疫治療技術已得到醫學界廣泛認同，甚至被認為是腫瘤治療領域中最有前景的癌癥治療方法。但不管是免疫檢查點單抗治療[4]還是以CAR-T 細胞療法為“先鋒”的過繼性免疫治療，T 細胞都是抗腫瘤免疫過程中的核心執行者[5]。CAR-T 免疫治療需要對患者自身的T 細胞進行基因工程改造，使其表達可特異性識別腫瘤細胞的CAR[6-9]，并在體外擴增后，回輸到病人體內發揮治療腫瘤的作用。CAR-T 細胞治療在臨床上展現出很好的持久性、腫瘤殺傷能力、靶向性[10-11]及增殖能力[12]，被人們寄予厚望。

在CAR-T 細胞制備過程中，T 細胞的激活和擴增是一個關鍵步驟，會影響CAR-T 細胞的制備周期和最終CAR-T 細胞的狀態。常規的T 細胞激活方式是通過抗CD3 和CD28 的抗體刺激，或將T 細胞與包被anti-CD3/CD28 的磁珠共同孵育。Tumaini 等[13]同時比較了2 種T 細胞激活方法，發現磁珠法可避免中間分離步驟，且產生的總擴增倍數也高于OKT3（抗CD3 的抗體）激活。之前的研究也顯示，抗CD3 和CD28 的抗體刺激可以產生適度的T 細胞激活[14]，而磁珠可提供類似天然抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APCs）的作用，激活能力可極大地增強[15-16]。然而，不同的磁珠激活條件可能會影響T 細胞的激活效果，但目前針對其激活條件優化的相關研究報道較少。在本研究中，我們分析比較了3 種T細胞激活條件對激活早期細胞活力、CD3+T 細胞所占比例和T 細胞增殖速度的影響，從而優化T細胞激活條件，以在較短的時間內制備獲得CAR-T 細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

青霉素-鏈霉素（雙抗）、胎牛血清（FBS）、白細胞介素2（IL-2）、磷酸緩沖液（PBS）、Gluta?MAX-1（100×）、AIM-V CTS、Dynabeads CD3/CD28 CTS均購自Life Technologies公司；Ficoll-Paque PLUS購自GE公司；APC-isotype、APC antihuman CD3購自Biolegend公司；細胞計數板、AO/PI 染料 購自Biolegend公司；Cellometer Auto 2000細胞計數儀和Guava easyCyte流式細胞儀分別為Nexcelom和Millipore公司產品。

1.2 人外周血單個核細胞分離

在知情同意情況下，從健康志愿者體內采集新鮮血液，負壓抽取到采血抗凝管中。全血經PBS 等體積稀釋后，沿著離心管壁緩慢覆蓋在Fi?coll-Paque PLUS 上層，用密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），每10 mL 肝素化全血經處理后可得到約1×107PBMCs。經過2 次洗滌細胞，分離后的PBMCs 用含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、1% Glutamax-1 和100 IU/mL IL-2 的AIM 培養基重懸，于37℃，5% CO2細胞培養箱中培養，2～3 d 后更換新鮮培養基。所有PBMCs 或直接用于實驗；或重懸于含90% FBS 和10%DMSO 的凍存液中，于-80℃凍存。

1.3 T細胞激活

T 細胞激活采用結合有抗CD3 和抗CD28 抗體的磁珠實現。細胞計數后，1200 r/min 離心5 min 收集獲得PBMCs，再將PBMCs 與磁珠數按一定的比例混合（兩者的比例分別為1∶3、1∶1、3∶1），用5% FBS 重懸細胞至終濃度為1×108/mL，在22℃室溫下，以3 r/min 的速度放于垂直混合儀上充分混勻約30 min，孵育完成后的T 細胞再次計數，并以5×105～10×105/mL 的密度用AIM 完全培養基培養。

1.4 T細胞計數

用細胞計數儀檢測不同激活條件下的T 細胞活力及活細胞數。取出15 μL 吹吸混勻的細胞懸液，與相同體積的AO/PI 染料混勻，向計數板的加樣孔中加入約20 μL 兩者混合液，在“immuno cell，low RBC”模式下，獲得活細胞密度及直徑等相關信息。按照下式分別計算活細胞總數和T 細胞活力：

圖1 不同激活條件下PBMCs 的活力及細胞直徑分布

1.5 流式細胞術檢測CD3+T細胞比例

用流式細胞儀檢測CD3+T 細胞比例。分別在T 細胞激活前后收集細胞，置于流式管中，洗滌3 次后用100 μL PBS 重懸細胞，分別向管中加入APC 標記的anti-human CD3 抗體及Isotype 對照抗體，4℃避光染色30 min，再次將細胞清洗3 次以除去游離染料，用300 μL PBS 重懸細胞，用Gua?va 流式儀檢測，用相關軟件分析得到的數據。

2 結果

2.1 激活條件對細胞活力的影響

將細胞與磁珠于22℃共孵育30 min，使得兩者充分接觸。3 種激活條件下的細胞用AO/PI 染色，細胞計數儀分析結果如圖1A。孵育30 min后，隨著磁珠數的增加，細胞活力呈遞減趨勢。當PBMCs 數與磁珠數比例為3∶1 時，細胞活力約為70%；當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，細胞活力為60%左右；而當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶3 時，活力僅為55%左右。

同時，我們也檢測了不同激活條件下細胞的直徑。細胞直徑是表征細胞大小及狀態的重要參數。經過短暫的激活后，不同激活條件下的活細胞主要直徑范圍稍有差別（圖1B）。激活前，活細胞主要直徑范圍為7.7～9.7 μm，此范圍細胞占細胞總數的80%以上；PBMCs 數與磁珠數比例為3∶1 時，活細胞主要直徑范圍為9.7～10.7 μm，范圍內細胞占細胞總數的50%左右；PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，主要直徑范圍為8.7～9.7 μm，占細胞總數的33%左右；而PBMCs 數與磁珠數比例為1∶3 時，主要直徑范圍為7.7～8.7 μm，目標細胞數占細胞總數的25.7%左右。然而，4 種情況下，死細胞直徑范圍基本一致。以上結果表明，經磁珠短暫孵育激活，對PBMCs 的細胞活力會有較大影響。

圖2 不同激活條件下的淋巴細胞群分離

2.2 磁珠比例對激活早期CD3+T細胞的影響

PBMCs 中的T 細胞是CAR-T 細胞治療的核心執行者，因此我們接下來著重分析了3 種激活條件對CD3+T 細胞的影響。如上所述，細胞與磁珠按一定比例混勻孵育后，分別進行抗CD3 抗體標記，并用流式細胞儀檢測。首先通過FSC/SSC（前向散射光/側向散射光）分離淋巴細胞群，結果如圖2。激活前的淋巴細胞占總細胞的24.2%；而激活后，淋巴細胞群的比例隨著用于T 細胞激活的磁珠數目不同而有所變化。當PBMCs 與磁珠比例為3∶1 時，淋巴細胞總數占PBMCs 總數的29.6%；當PBMCs 與磁珠比例為1∶1 時，淋巴細胞數占14.2%；而當PBMCs 與磁珠比例為1∶3 時，淋巴細胞數僅占6.05%。

隨后，進一步檢測了3 種激活條件下CD3+T細胞占淋巴細胞的比例，結果如圖3。相對于同型對照而言，激活前的CD3+T 細胞占淋巴細胞總數的64.5%；而隨著用于T 細胞激活的磁珠增加，激活后CD3+T 細胞的比例也呈遞減趨勢。當PBMCs 數與磁珠數比例為3∶1 時，CD3+T 細胞占淋巴細胞總數的60%左右；當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，CD3+T 細胞占淋巴細胞總數的34.1%；而當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶3 時，CD3+T 細胞卻只占淋巴細胞總數的28.1%左右。這一結果表明，用于T 細胞激活的anti-CD3/CD28磁珠數目過多，會導致CD3+T 細胞死亡，而這也是導致PBMCs 整體活力降低的主要原因。

2.3 T細胞激活對增殖的影響

好的激活條件應當能有效促進T 細胞增殖，而這會影響整個CAR-T 細胞制備的周期。基于此，我們檢測了不同激活條件對細胞增殖速度的影響。PBMCs 與磁珠孵育30 min 后，3 種激活條件處理的細胞連續培養15 d。通過在不同培養時間下統計細胞數（孵育30 min 后計數得到的細胞總數作為第0 d 細胞），發現3 種激活條件下的T 細胞生長趨勢大體一致（圖4）。在激活后培養的初期（0～3 d），3 種激活條件下的細胞總數基本無變化，細胞總體處于生長緩慢的適應期；培養一段時間后進入快速生長期。其中，以PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時細胞增殖最為明顯，連續檢測至15 d，細胞仍處于快速生長期，而且在第15 d 時細胞數已擴增約50 倍；而其他2 種條件下的T 細胞，在培養8 d 之內細胞數都沒有明顯增長，培養至15 d 時細胞總數擴增了僅約15 倍。實驗結果表明，PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 進行T 細胞激活時，更利于T 細胞的擴增。

圖3 不同激活條件下CD3+ T 細胞所占比例

圖4 不同激活條件下T 細胞生長曲線

3 討論

CAR-T 細胞的制備過程包括PBMCs 分離、激活及外源基因導入等步驟，其中T 細胞的激活是細胞增殖及CAR-T 細胞制備的基礎。天然T 細胞的活化、增殖和分化需要2 種信號：第一種是T細胞表面受體（TCR）同抗原呈遞細胞上的MHC/抗原復合物的特異性相互作用，此信號是必需的，但不能充分激活細胞；第二種是共刺激信號，通過T 細胞表面的共刺激受體（如CD28、4-1BB、OX-40）與靶細胞或抗原呈遞細胞表面相應配體（如B7、4-1BBL、OX-40L）的結合。這一信號對于IL-2/IL-2R 的誘導表達及T 細胞增殖分化為成熟的效應T 細胞而言，都是至關重要的[17]。而從血液中分離獲得的人外周血淋巴細胞，與包被抗CD3 和CD28 抗體的磁珠結合后，可同時為T 細胞提供激活和擴增所需的初始及共刺激信號。已有研究表明，這種方式可以有效地在體外激活T細胞。目前各種研究中多將3 倍PBMCs 數量的磁珠直接加入T 細胞培養基中[18-19]。

本研究采用PBMCs 與磁珠在高密度條件下于22℃孵育30 min 的方式對T 細胞進行激活，PBMCs 與磁珠的比例分別為3∶1、1∶1 和1∶3。研究結果顯示，磁珠比例增加，會導致CD3+T 細胞大量死亡。其原因可能是過多的磁珠導致重復的T 細胞激活，從 而誘導Fas 和FasL 以及FLIP 的表達，最終引起激活誘導的細胞死亡。此外，營養限制、有毒廢物累積或細胞臨界培養密度限制等也是影響細胞活力的潛在因素[20]。而且，過多的磁珠激活會影響用于進一步培養的T 細胞數量。根據本研究的數據估算，從健康志愿者體內獲得10 mL 新鮮血液（大約能分離獲得1×107PBMCs），采用PBMCs 與磁珠比例為1∶3 的條件激活細胞時，激活30 min 后最終可用于進一步培養的CD3+T 淋巴細胞數只有1.7×105左右；而當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，得到的T 淋巴細胞數可達4.85×105左右。更重要的是，激活條件還會影響T 細胞的增殖速度。當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，T 細胞擴增速度是其他2 種條件下的3 倍。這可能與當磁珠數用量過多時，導致其他單核細胞的丟失有關。因為研究表明未分離的淋巴細胞比純化的T 細胞單獨培養更有優勢，大量存在的單核細胞會通過結合T 細胞表面分子和釋放細胞因子（通過旁分泌和自分泌的方式）來共激活T 細胞[21-22]，從而促進T 細胞增殖、細胞因子分泌等功能。

值得注意的是，1∶3的PBMCs與磁珠比是CAR-T 細胞相關研究常用比例[23-25]。但本研究結果顯示，在這一激活條件下，整體細胞活力和CD3+T 細胞比例都是最弱的，T 細胞增殖速度也并不突出。而當PBMCs 與磁珠比為3∶1 時，細胞活力和CD3+T 細胞比例方面最好，但這是以T 細胞的不能充分激活為代價的，這一條件下需要更長的時間使T 細胞進入快速增長期。PBMCs 與磁珠比為1∶1 時磁珠激活T 細胞的效果更好，所以即使起始擴增的T 細胞數相對于3∶1 時較少，T 細胞的增長速度仍最快。而1∶3 可能會導致過多的磁珠刺激，引發T 細胞死亡和單核細胞丟失。這說明1∶3 并不是T 細胞激活的最適條件。

綜上所述，我們用包被抗CD3 和CD28 抗體的磁珠激活T 細胞，通過比較3 種激活條件，發現PBMCs 與磁珠比例在早期即對細胞活力、CD3+T細胞比例以及細胞增殖速率有較大影響，并提供了一個相對于現行方法更佳的PBMCs 與磁珠比例。當PBMCs 數與磁珠數比例為1∶1 時，有利于T 細胞的快速擴增，這對于在較短時間內獲得足夠的T 細胞，縮短整個CAR-T 細胞制備周期具有較重要的意義。