納米磁珠偶聯CFP-10特異性單抗富集結核分枝桿菌方法的建立

張佳，張景海，馮曉燕，張賀秋

1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽110016；2.東方海洋（北京）醫學研究院，北京100070

結核病是通過呼吸道傳播，由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，隨著病情不斷惡化而導致全身多系統疾病[1]，嚴重損害人類健康。據世界衛生組織（WHO）統計，2016年全球新發現的結核病例約1040 萬，中國新發病例占全球的8.6%[2]，是排名世界第三的結核病高負擔國家，結核病疫情的防控刻不容緩。目前結核病的診斷仍主要依賴于傳統的結核分枝桿菌培養和痰涂片抗酸染色[3]。涂片抗酸染色鏡檢觀察法是細菌學檢測常用的方法，但是由于敏感性低，對細菌的數量要求較高，只有當痰液中細菌數達到5000～10000/mL 才能檢測到抗酸菌，陽性檢出率較低。因此，對標本中致病菌進行富集，對提高細菌學檢查的陽性率至關重要。傳統的富集方法存在各種不足，仍滿足不了臨床需要。作為一種新型富集方法，磁珠富集法受到越來越多研究者的關注，正逐漸應用到結核病的診斷中。

培養濾液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）由結核分枝桿菌的RD1 區基因Rv3874編碼[4]，在體內和早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）形成1∶1 異二聚體復合物而發揮生物學功能，激發強烈的特異性T 細胞應答[5]。由于CFP-10 所在的RD1 區只存在于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，而其他分枝桿菌及卡介苗（BCG）中均缺失該區序列[6]，因此成為結核病診斷研究的熱點。我們制備了CFP-10 特異性單抗，并將該抗體與納米磁珠偶聯，用于捕獲富集結核分枝桿菌，以期能夠提高痰樣本抗酸染色檢測的陽性檢出率。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性BALB/c 小鼠（8～10 周齡）購自北京維通利華實驗動物有限公司；結核分枝桿菌H37Rv 株由中國疾病預防控制中心提供；大腸桿菌HB101感受態由本實驗室保存；原核表達質粒pBVIL1 由本實驗室構建并保存；抗CFP-10 單克隆抗體雜交瘤細胞株1028 為本實驗室前期制備保存；DNA限制性內切酶XhoⅠ、XbaⅠ及T4DNA 連接酶購自Promega 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow 購自GE Health?care 公司；RPMI-1640 培養基購自Gibco 公司；胎牛血清購自康源生物公司；琥珀酰亞胺磁珠購自上海醫脈賽生物科技有限公司。

DYY-10C 電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR儀、Bio-PlexPro Wash Station（BIO-RAD 公司）；3-18K 低溫高速離心機（Sigma 公司）；酶標板（廈門怡佳美實驗器材有限公司）。

1.2 CFP-10抗原制備

1.2.1 重組質粒的構建及鑒定 以結核分枝桿菌H37Rv株的DNA為模板，針對CFP-10的開放讀框設計擴增引物CFP-10-F（5′-GCGTCGACGAA GCAGCCAATAAGCAG-3′，下劃線序列為SalⅠ酶切位點）和CFP-10-R（5′-GCTCTAGAATGGTGAT GGTGATGGTGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3′，下劃線序列為XbaⅠ酶切位點）。PCR 擴增，片段酶切后連接到原核表達載體pBVIL1，構建pBVIL1-CFP-10 重組質粒，將重組質粒轉化大腸桿菌HB101 感受態，挑取單菌落送北京天一輝遠生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.2 目的蛋白表達及純化 將測序正確的重組表達質粒轉化大腸桿菌HB101 感受態，挑取單菌落于3 mL 含氨芐西林鈉的LB 液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日接種于新鮮的LB 液體培養基中培養至對數期后于42℃過夜誘導。SDSPAGE 分析目的蛋白及表達形式。將pBVIL1-CFP-10 菌液擴大培養發酵，Ni 柱親和層析純化蛋白，紫外分光光度計測定蛋白濃度。

1.3 CFP-10單抗制備

1.3.1 單抗制備與純化 復蘇1028 雜交瘤細胞，用含10%胎牛血清的1640 培養基培養；每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，10 d 后收集細胞，用10 mL 生理鹽水重懸細胞，每只小鼠腹腔注射0.5 mL（細胞密度約為1×107/mL）；2周后收集腹水，硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.3.2 ELISA 法測抗體效價 用碳酸鹽包被緩沖液稀釋CFP-10 抗原濃度為2.5 μg/mL，每孔包被100 μL。用抗體稀釋液分別將CFP-10 單抗稀釋至1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/20000、1/40000、1/80000、1/160000、1/320000、1/640000、1/1280000，100 μL/孔加樣并設置空白孔（100 μL 抗體稀釋液）。用酶標儀雙波長（450 nm/630 nm）測定各孔的吸光度值。

1.3.3 磁珠偶聯CFP-10 單抗 取50 μL（2.5 mg）納米磁珠（粒徑300 nm）于EP 管中，用洗滌緩沖液洗滌磁珠，磁場吸附，棄上清；用偶聯緩沖液重懸磁珠和稀釋CFP-10 單抗；將等體積的重懸磁珠和偶聯蛋白溶液置于旋轉混合儀中，4℃振蕩過夜；磁場分離磁珠，移除含蛋白的上清液，紫外分光光度計測定蛋白濃度；加入封閉緩沖液重懸磁珠，置于旋轉混合儀中，室溫混合4 h；磁場吸附，棄上清；用封閉緩沖液洗滌偶聯蛋白的磁珠，磁場吸附，棄上清；用1 mL 封閉緩沖液重懸磁珠，于2～8℃儲存。

1.4 磁珠偶聯CFP-10單抗的驗證

1.4.1 HRP 標記CFP-10 單抗 用碳酸鹽緩沖溶液調整CFP-10 單抗濃度為5 mg/mL 待用。用分析天平稱量10 mg HRP，溶于蒸餾水中避光攪拌；緩慢滴加NaIO4水溶液避光攪拌；緩慢滴加乙二醇室溫攪拌；將活化好的HRP 溶液分2 等份加入2 種抗體中，4℃透析過夜；加NaBH4混勻，4℃冰箱中放置2 h；加等體積的甘油混勻，-20℃保存。

1.4.2 雙抗體夾心ELISA 法測定 偶聯CFP-10單抗的磁珠用PBS 緩沖液稀釋至1/10，100 μL/孔；調整CFP-10 抗原濃度依次為1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、62.5 ng/mL、6.25 ng/mL，每孔加入100 μL（對照組無關抗原稀釋同上）；室溫振蕩孵育1 h，磁珠洗板機洗滌5次；酶稀液稀釋HRP 標記的CFP-10 單抗，100 μL/孔；室溫振蕩孵育30 min，磁珠洗板機洗滌5次；顯色液A 與顯色液B（1∶1）混合，100 μL/孔，37℃避光10 min；硫酸終止液50 μL/孔終止反應；采用酶標儀雙波長（450 nm/630 nm）測定各孔的吸光度值。

1.4.3 免疫熒光法測定 取10 μL 偶聯抗體的磁珠及等量未偶聯抗體的空磁珠，均勻涂在黏附性玻片上自然晾干；分別設置實驗組（偶聯抗體的磁珠+二抗）、對照組（空磁珠+二抗）；山羊抗小鼠FITC 標記的二抗用PBS 稀釋至1/200 后加100 μL覆蓋在磁珠上，避光孵育1 h；PBS 洗滌后用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 磁珠富集結核分枝桿菌抗酸染色

用超聲波細胞破碎機將結核分枝桿菌聚集的團塊分散，紫外分光光度計測得吸光度值，計算結核分枝桿菌濃度，詳情參考文獻[7]。將已知濃度的結核分枝桿菌稀釋后取總菌量為50 000、3000 和300 的分枝桿菌，均分成2 份，設置實驗組與對照組。實驗組：不同總菌數的結核分枝桿菌懸液加入稀釋至1/10 后體積為10 μL 的偶聯抗體的磁珠，加PBS 緩沖液使各組混懸液體積補齊至100 μL，室溫振蕩富集1 h 后進行抗酸染色。對照組：直接將同等總菌數的結核分枝桿菌懸液涂片后進行抗酸染色。

2 結果

2.1 CFP-10抗原制備

2.1.1 CFP-10 基因的克隆及鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結果表明，CFP-10 基因的PCR 擴增產物與預期大小一致，基因長度為111 bp（圖1）。

2.1.2 CFP-10 的誘導表達及純化鑒定 SDSPAGE 分析pBVIL1-CFP-10 誘導表達菌液，目的蛋白主要以包涵體形式表達。重組蛋白由150 個氨基酸殘基的pBVIL1 重組載體和37 個氨基酸殘基的目的蛋白CFP-10 組成，在相對分子質量23×103處有比較明顯的特異蛋白表達帶，與預期大小相符（圖2）。pBVIL1-CFP-10 菌液擴大培養發酵，Ni 柱親和層析純化蛋白，紫外分光度計測定CFP-10 抗原濃度為0.7 mg/mL。

2.2 CFP-10單抗制備

硫酸銨沉淀法純化小鼠腹水中的CFP-10 單抗，紫外分光光度計測得單抗濃度為6.5 mg/mL，ELISA 法測得單抗效價為1∶640 000（圖3）。

2.3 磁珠偶聯CFP-10單抗及驗證

圖1 CFP-10 基因擴增結果

磁珠偶聯加入CFP-10 單抗7.5 mg。偶聯后經磁場移除磁珠的上清液CFP-10 單抗剩余量為5.8 mg，計算出磁珠偶聯上CFP-10 單抗1.7 mg。雙抗體夾心法偶聯抗體能檢測到抗原的最低濃度為62.5 ng/mL（圖4）。免疫熒光實驗顯示偶聯上抗體的磁珠與FITC 標記的二抗孵育后可見熒光，而對照無熒光（圖5）。

圖2 CFP-10 表達的SDS-PAGE 鑒定

圖3 CFP-10 單抗抗體效價鑒定

圖4 磁珠偶聯CFP-10 單抗ELISA 鑒定折線圖

圖5 偶聯CFP-10 特異性單抗磁珠的免疫熒光鑒定圖（×40）

圖6 結核分枝桿菌抗酸染色圖（×100 油鏡）

2.4 磁珠富集結核分枝桿菌抗酸染色

將結核分枝桿菌調整為總菌數分別為50 000、3000、300 的菌懸液，設置為利用偶聯CFP-10 特異性單抗進行富集的實驗組和未進行富集的對照組，分別進行抗酸染色，結果如圖6。與對照組相比，含不同數量菌懸液的3 個實驗組中結核分枝桿菌均明顯多于對照組，且結核分枝桿菌多富集在磁珠周圍，說明磁珠偶聯CFP-10 特異性單抗能有效富集結核分枝桿菌。

3 討論

2014年世界衛生大會提出到2035年消滅全球結核病預防、控制和治療策略[8]，這給發展中國家結核病防控提出了嚴峻挑戰。目前結核病的檢測仍主要依賴于細菌學方法，富集結核分枝桿菌能提高結核病的陽性檢出率，對于結核病的預防和控制至關重要。傳統的富集方法仍存在各種不足，如離心沉淀法在操作中樣本暴露在外，存在生物安全隱患；漂浮集菌法高壓滅菌時間相對較長，但漂浮到液面的結核分枝桿菌仍不能保證完全黏附在玻片上，并受實驗者主觀因素影響；夾層杯法富集后導致嚴重背景干擾，易出現假陽性，影響最終實驗結果。近年來，國外介紹了利用超順磁性顆粒珠富集分枝桿菌，因其具有快速簡便、不需要特殊儀器、穩定性高、無須冷藏保存等優點，除了被用來分離富集標本中的細菌及細胞外[9-10]，也有將其用于富集分枝桿菌，尤其是免疫磁珠。Grant 等[11]用磁珠連接抗副結核分枝桿菌的多克隆抗體，通過外加磁場沉淀牛奶標本中的副結核分枝桿菌，沉淀物用金胺“O”熒光染色鏡檢。

本研究首次用納米磁珠偶聯針對致病性結核分枝桿菌抗原的CFP-10 單抗。CFP-10 所在的RD1 區只存在于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，因此我們制備的免疫磁珠增加了結核分枝桿菌的特異性。本實驗結果表明，實驗組納米磁珠偶聯上CFP-10 特異性單抗富集結核分枝桿菌總數明顯多于對照組，且被染成紫紅的結核分枝桿菌與納米磁珠的褐色背景形成鮮明的顏色對比，在鏡下形態清晰容易找到，富集效果良好，證明了初步建立的富集方法可行，為提高結核病臨床細菌學檢測的陽性檢出率奠定了基礎。