利用核磁共振（31P-NMR）測定b型流感嗜血桿菌莢膜多糖中磷含量的新方法研究

普元倩，朱文勇，吳雅楠，靳瑋華，李衛(wèi)東，廖國陽

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理671000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明650018

b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b，Hib）是引起嬰幼兒嚴(yán)重細(xì)菌感染的主要致病菌，可導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、敗血癥、會厭炎、蜂窩組織炎、心包炎、脊髓炎等多種侵襲性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球每年約330 萬5 歲以下兒童受到Hib 感染，其中38 萬～50 萬兒童死于Hib 感染性疾病，并且有30%～40%的兒童出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥與殘疾[1]。Hib 疫苗的研發(fā)和使用能夠降低Hib 疾病的發(fā)病率。在Hib 疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程中，其莢膜多糖的質(zhì)量控制至關(guān)重要，其中包括血清型鑒定，磷含量、蛋白含量、核糖含量的測定等。傳統(tǒng)上采用《中國藥典》三部（2010 版）收錄的化學(xué)法對Hib 莢膜多糖中的磷含量進(jìn)行測定。由于這類方法一般使用強(qiáng)腐蝕性酸，操作復(fù)雜、危險系數(shù)高，且靈敏度較低，有時易受到干擾，不能用于細(xì)菌培養(yǎng)過程中多糖磷含量的檢測。定量核磁共振波譜（quantitative nucle?ar magnetic resonance spectroscopy，QNMR）方 法操作簡便，樣品用量少，無其他元素干擾，無需對照品即可進(jìn)行定量分析。 目前QNMR 包括1H-、13C-、19F-、31P-、14N-、15N-NMR 及一些二維技術(shù)[2]，廣泛應(yīng)用于化學(xué)藥物[3-4]、食品農(nóng)業(yè)[5-6]、中藥與植物提取物[7-8]、代謝組學(xué)[9-10]、生物學(xué)[11-12]等研究領(lǐng)域。在細(xì)菌多糖質(zhì)量控制中，氫核磁共振波譜（1H-NMR）技術(shù)已用于原料多糖的型別鑒定[13-14]、含量測定、計算多糖中特異化學(xué)基團(tuán)（如O-乙酰基）的含量[15]、多糖純度（如Pn C-PS、殘余化學(xué)試劑）分析[14]。目前，NMR 已經(jīng)是《歐洲藥典》和WHO 推薦的多糖質(zhì)量控制方法[17-18]。我們運(yùn)用31P-NMR 譜的定量功能，采用內(nèi)標(biāo)法，摸索適當(dāng)?shù)臏y試條件，并與傳統(tǒng)化學(xué)方法進(jìn)行比較，建立了31P-NMR 測定Hib 莢膜多糖中磷含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸氫二鉀（99%純度）、六甲基磷酰三胺（99%純度，為核磁共振化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)試劑）購自Sigma公司；Hib莢膜多糖（批號：20130826，20130909，20130923；2～8℃保存）由昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室制備；重水（D2O，99.9%純度）購自CIL 公司；硫酸購自川東化工集團(tuán)有限公司；高氯酸購自金鹿化工有限公司；鉬酸銨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉購自西隴化工股份有限公司；1-氨基-2-萘酚-4-磺酸購自上海金山亭新化工試劑廠；蒸餾水由昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備；400 MHz 核磁共振儀購自Bruker 公司；四環(huán)凍干機(jī)購自北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；連續(xù)波長酶標(biāo)儀購自Thermo 公司；核磁共振樣品管（d=5 mm）購自Wilmad-Lab?Glass 公司。

1.2 NMR法

1.2.1 核磁法樣品配制 用D2O 分別配制50 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液、50 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液、100 mmol/L Hib 莢膜多糖樣品溶液，其中Hib 多糖以其重復(fù)單元計算物質(zhì)的量，每一重復(fù)單元相對分子質(zhì)量為368[19]（磷酸二氫鉀、3 批樣品多糖、內(nèi)標(biāo)試劑均先冷凍干燥過夜）。

1.2.231P-NMR 譜參數(shù)設(shè)置31P-NMR 圖譜采集所用儀器參數(shù)設(shè)置見表1。

1.2.3 核磁定量精密度、重復(fù)性及精確度驗證取100 μL 磷酸氫二鉀溶液、300 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，加D2O 600 μL 混勻，配制成終濃度為5 mmol/L 磷酸氫二鉀溶液和15 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液混合液，取550 μL 至核磁樣品管。同法配制10、15、20、25 mmol/L 樣品混合液，內(nèi)標(biāo)終濃度固定為15 mmol/L。每個濃度均配制5 個平行核磁樣品，分別按表1 優(yōu)化參數(shù)設(shè)置進(jìn)行31P-NMR 測試。利用31PNMR 譜圖中質(zhì)子峰面積與質(zhì)子數(shù)成正比的原理，通過下式[20]計算含量，進(jìn)而進(jìn)行平均值、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、誤差和相對誤差的分析。

式中，WS為樣品質(zhì)量，AS為樣品定量峰面積，nS為樣品定量峰包含磷原子數(shù)，WR為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，AR為內(nèi)標(biāo)定量峰面積，nR為內(nèi)標(biāo)定量峰包含磷原子數(shù)，MS為樣品摩爾質(zhì)量，MR為內(nèi)標(biāo)摩爾質(zhì)量，S為磷酸氫二鉀，R為六甲基磷酰三胺。

1.2.4 核磁法測定Hib 莢膜多糖中的磷含量 分別取3 批多糖溶液300 μL、內(nèi)標(biāo)溶液300 μL，加D2O 400 μL 混勻，吸取550 μL 至核磁樣品管，配制成含15 mmol/L 多糖和15 mmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2 項參數(shù)設(shè)置進(jìn)行31P-NMR 測試。同樣利用上述公式得到多糖中的磷含量。

1.3 化學(xué)法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用蒸餾水配置20 μg/mL磷酸氫二鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 μg/mL 磷酸氫二鉀溶液（作為供試樣品）、100 μg/mL 3 批多糖樣品（磷酸氫二鉀、3 批多糖樣品均先冷凍干燥過夜），參照《中國藥典》三部（2010 版）附錄ⅦA 操作[21]，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 定量精密度、重復(fù)性及精確度驗證 先將100 μg/mL 磷酸氫二鉀樣品作為供試品用蒸餾水依次稀釋至6、9、12、15、18 μg/mL，每個濃度各5個平行，按《中國藥典》三部（2010 版）附錄ⅦA 操作[21]，測定吸光度值，代入回歸方程即得供試品質(zhì)量濃度，計算磷酸氫二鉀質(zhì)量，并計算平均值、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對誤差。

1.3.3 測定Hib 莢膜多糖中的磷含量 配制3 批100 μg/mL 多糖樣品溶液，參考《中國藥典》三部（2010 版）附錄ⅦA 進(jìn)行檢測[21]。

2 結(jié)果

2.1 磷酸氫二鉀31P-NMR譜

將一定量的內(nèi)標(biāo)物六甲基磷酰三胺溶液和磷酸氫二鉀溶液加入核磁管，按表1 優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行31P-NMR 測定，其31P-NMR 譜見圖1?？梢钥闯?，所選內(nèi)標(biāo)物的定量峰a 與磷酸氫二鉀的定量峰b 完全分離，對不同的物質(zhì)峰進(jìn)行歸屬，在化學(xué)位移30 和0 ppm 出現(xiàn)2 個較大的尖銳峰，且無其他雜峰干擾。

2.2 NMR法的精密度及準(zhǔn)確度

公式計算結(jié)果如表2 所示，不同濃度的相對誤差均小于3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）除最低濃度（5 mmol/L)和最高濃度（25 mmol/L）外，均小于1.0%；其中，RSD 最小（0.7%）的樣品濃度為15 mmol/L，相對誤差也幾近最小（2.1%），表明該濃度下的數(shù)據(jù)精密度，重復(fù)性最好。

圖1 磷酸氫二鉀加入六甲基磷酰三胺31P-NMR 譜

2.2 化學(xué)法的精密度及準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。所有樣品的相對誤差均超過5%，明顯高于31P-NMR 法，說明精確性不如31P-NMR 法。不同濃度樣品的RSD 為1%～3%，18 μg/mL 時RSD 最 大（3.185%），12 μg/mL 時RSD 最?。?.222%），說明各平行濃度間重復(fù)性不夠好，可能由于炭化消化過程中玻璃試管壁厚度不均一導(dǎo)致受熱不均，有個別管底殘留液難以炭化，使得相對誤差與RSD 值偏大，見表3。

2.3 Hib多糖中磷含量的測定結(jié)果

31P-NMR 法定量Hib 多糖中的磷含量時，多糖定量峰在化學(xué)位移0.06 ppm 處呈獨(dú)立單峰（圖3，d 峰），與內(nèi)標(biāo)定量峰c 完全分離，其峰面積可以作為公式中的AS進(jìn)行計算。31P-NMR 法和化學(xué)法檢測的3 批多糖中的磷含量無明顯差異，均在《中國藥典》三部（2010 版）合格范圍內(nèi)（68～90 mg/g）（表4），表明2 種方法均可用于3 批多糖的磷含量檢測，且檢測結(jié)果均合格。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 31P-NMR法的精密度和精準(zhǔn)度

表3 化學(xué)法的精密度和精準(zhǔn)度

3 討論

磷含量是Hib 莢膜多糖質(zhì)量控制的一項重要檢測指標(biāo)。傳統(tǒng)化學(xué)法操作步驟多，人為操作及測量誤差不可避免；而31P-NMR 法只對磷原子有吸收峰，無其他元素的干擾，不破壞樣品，操作簡單、快速，相應(yīng)地減少了測量過程中誤差出現(xiàn)的幾率。本實(shí)驗中化學(xué)法所得結(jié)果與實(shí)際理論值的相對誤差控制在10% 以內(nèi)，但普遍高于31PNMR 法的相對誤差，因此，在精密度方面，31PNMR 法要優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)法。在重復(fù)性上，31PNMR 法的RSD 值遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)化學(xué)法，表明31PNMR 法較化學(xué)法更穩(wěn)定。

圖3 Hib 多糖加入六甲基磷酰三胺31P-NMR 譜

表4 31P-NMR法和化學(xué)法測定Hib多糖中的磷含量（mg/g）

在QNMR 中，當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為15 mmol/L時，磷酸氫二鉀定量峰面積與內(nèi)標(biāo)定量峰面積接近1∶1，其RSD 值（0.7%）最小，即精密度最好。綜合以上因素，采用核磁法測量Hib 莢膜多糖中的核糖含量時，應(yīng)選擇與內(nèi)標(biāo)定量峰面積相近的濃度進(jìn)行。

本研究建立了31P-NMR 法測定Hib 莢膜多糖中磷含量的方法，該方法精密度高、重復(fù)性好、精確度高，各方面均優(yōu)于化學(xué)法，且檢測快速準(zhǔn)確，不破壞原物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不依賴被測物的標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行定量分析，可作為檢測細(xì)菌多糖中磷含量的一個簡單、準(zhǔn)確、快捷的方法。