Vero細胞培養A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va流感病毒適宜條件研究

非成瑞，馬磊，高菁霞，崔兆海，宋紹輝，李衛東，廖國陽

中國醫學科學院 北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明650118

流感病毒目前仍是人類健康的重大威脅之一[1-3]。H7N9 流感病毒自2013年以來，在我國共計發生5 次人群感染暴發疫情，截至2017年8月7日，感染病例1557 例，其中605 人死亡，病死率高達38.86%[3]。疫苗接種是對抗流感病毒感染和傳播的最有效方法。20 世紀40年代以來，雞胚生產人用流感疫苗的方法已成功使用了數十年[4-5]。然而，當面臨流感大流行或生產針對高致病性甲型流感病毒的疫苗時，雞胚的生產能力有限，并且卵清蛋白的存在會引起過敏反應[6]。相比之下，基于細胞培養的生產系統可以更快速地生產疫苗，更容易擴大規模，不會引起過敏反應，并且有研究表明與MDCK 細胞和雞胚相比，在Vero 細胞中培養的甲型流感病毒血凝素蛋白（hemagglu?tinin，HA）糖基化方式與在人呼吸道上皮細胞分離出的流感病毒更接近，用Vero 細胞培養的流感疫苗可能能更好地介導人體產生對流感的免疫應答[7]，該細胞系的安全性已得到充分證實[8]，世衛組織建議將Vero 細胞作為流感疫苗生產的替代基質，這也是流感大流行應急儲備的一項重要內容。在本研究中，我們用Vero 細胞作為培養基質，培養反向遺傳學技術重組獲得的H7N9 病毒株，對其培養條件進行優化后連續傳代15 代得到Vero 細胞適應的H7N9 高產株，并對細胞工廠進行大規模培養條件優化，病毒產量穩定，可實現大規模生產。

1 材料與方法

1.1 材料

143 代Vero 細胞來源于美國ATCC；甲型流感病毒Vero 細胞適應株A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va，是由H3N2 流感病毒Vero 細胞適應株的6 個基因片段（PB1、PB2、PA、NP、M、NS）與H7N9 的2 個基因片段（HA、NA）重配獲得，該重配毒株的減毒特性已在動物實驗中得到證實[9]。細胞和毒株均由中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所生物制品五室保存。

DMEM/F12 培養基購自Gibco 公司；MEM 基礎培養基和PBS 由中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所溶液組提供；TPCK 胰酶購自Worthington 公司；牛血清白蛋白（BSA）購自北京索萊寶科技有限公司；細胞工廠購自賽默飛世爾科技有限公司；流感病毒吸附液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶）、維持液［DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺和0.5%雙抗（10 kU/mL 青霉素+10 mg/mL 鏈霉素）為基本成分，添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶等］由云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室制備。

1.2 病毒培養條件的優化

采用單一變量法，分別對病毒接種MOI、培養溫度、pH 值和TPCK 胰酶等毒株培養條件進行優化。向基本成分中加入不同濃度的TPCK 胰酶，分別配制病毒吸附液和維持液。T225 細胞培養瓶中長成致密單層的Vero 細胞經0.125%的胰蛋白酶消化后傳代至T25 瓶中，置37℃培養48 h；細胞長滿致密單層后用PBS 洗3 次，因為細胞培養液中血清類淀粉蛋白P 會抑制甲型流感病毒表面唾液酰化糖蛋白的活性，影響病毒的產量[10]，根據不同條件接種H7N9 型重配流感病毒，置37℃培養吸附1 h；加入病毒維持液后于33℃繼續培養72 h 后收集培養液，3000r/min 離心20 min，收集上清液，測定血凝滴度[11]。

1.3 病毒在Vero細胞中的連續傳代培養

Vero細胞生長至對數生長期后，H7N9病毒用吸附液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加1.5μg/mLTPCK胰蛋白酶和NaHCO3至pH值為7.4）以1∶1000稀釋后接種Vero細胞，于34℃吸附1h后補加維持液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加0.3mg/mLBSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶，添加NaHCO3至pH值為7.4），于34℃繼續培養，感染48h后補加TPCK胰酶至1μg/mL，72h后收集培養上清，3000r/min離心20min，收集上清液，測定血凝滴度，凍存于-80℃。所收獲的病毒液以1∶1000稀釋后繼續接種對數生長期的Vero細胞。如此連續傳代至第15代。

1.4 測定病毒TCID50

將MDCK 細胞用0.125%胰酶消化后計數，以1.5×104/孔的數量加到96 孔板中，于37℃、0.5%CO2恒溫培養箱中培養，24h 后細胞長滿致密單層，用病毒稀釋液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和2 μg/mL TPCK 胰酶，并添加NaHCO3至pH 值為7.2～7.6）將病毒進行1/10 梯度稀釋，每個稀釋度8 個孔，每孔100 μL 病毒稀釋液，于34℃、0.5%CO2恒溫培養箱中培養72 h，收獲病毒感染細胞上清液，測定血凝效價，按Reed-Meunch 法計算病毒感染性滴度（TCID50/mL）。

1.5 細胞工廠大規模培養及工作種子批的制備

按照優化的H7N9 流感病毒培養條件，用細胞工廠培養病毒。細胞工廠規格為10 層托盤，培養面積6320 cm2，培養細胞數量最高可達16 億，一個細胞工廠的病毒液產量為1.5 L。但是，利用細胞工廠大規模培養病毒時，病毒吸附這一步驟使生產工藝變得繁瑣。為簡化Vero 細胞大規模生產流感病毒的工序，通過實驗對比吸附和不吸附接種病毒，檢測病毒收獲液的血凝效價，同時接種20 個細胞工廠，其中10 個用以MOI 為0.001 稀釋后吸附1 h 再補加維持液接種病毒，其余則將病毒按MOI 為0.001 直接用維持液稀釋接種Vero 細胞。同時為制備工作種子批，接種18 個細胞工廠，收獲病毒液，6000 r/min 離心15 min 去除細胞碎片，以13 mL/支分裝，凍存于-80℃。

1.6 統計學分析

所有實驗條件重復3 次，數據采用Graphpad軟件分析，以x±s表示各指標水平，組間差異性檢驗采用方差分析（Ordinary one-way ANOVA），P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒培養條件

在其他條件保持一致情況下，分別以MOI 為0.001、0.01、0.1、1.0 接種病毒，血凝效價統計學結果無顯著性差異（圖1A），雖然MOI 為1 和0.1 時細胞在50～60 h 全部病變，MOI 為0.01 和0.001 則需要66～72 h，但是在建立毒種時要求毒種能以最小接種量達到最大產量，且大規模生產疫苗時需要在快速生產疫苗的同時節約成本，因此最終確定最佳接種MOI 為0.001。分別在33℃、33.5℃、34℃、34.5℃和35℃下培養H7N9 流感病毒，34℃、34.5℃和35℃的結果顯示無顯著性差異，均可達到較高的血凝滴度（圖1B）。分別以pH 值為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8 和8.0 培養H7N9 病毒，最終得到最佳培養pH 值為7.4（圖1C）。由于流感病毒增殖過程中需要TPCK 胰酶使血凝素前體蛋白（hae?magluttinin precursor，HA0）裂解為HA1 和HA2 后才具有感染性，在吸附液和維持液中須添加一定量的TPCK 胰酶，并且為了保障新的病毒可以繼續復制，需要在病毒培養一段時間后進行補加，但實驗證明過多的TPCK 胰酶會對細胞造成損傷，反而會影響病毒的復制。設置TPCK 胰酶添加量分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 μg/mL，并且在48 h 后補加量為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，最終得到的TPCK 胰酶添加量和病毒培養48 h 后的補加量分別為1.5 μg/mL（圖1D）和1.0 μg/mL（圖1E）。

綜上所述，該重配H7N9 流感病毒的最適培養條件為：以MOI 為0.001 接種病毒，培養液pH 值為7.4，TPCK 胰酶添加量為1.5 μg/mL 時，于34～35℃培養48 h，補加TPCK 胰酶至終濃度為1.0 μg/mL，培養72 h 左右，待細胞完全病變時收獲培養液。

2.2 病毒連續傳代結果

用優化后的培養條件接種病毒，病毒收獲后以1∶1000 稀釋，連續傳至15 代，檢測每一代的血凝效價和病毒感染性滴度。結果表明，病毒的血凝效價和TCID50隨著傳代代次逐漸提高，血凝效價最高可達512，TCID50最高可達到108.5/mL，并保持相對穩定（圖1F）。且病毒感染Vero 細胞后，72 h 內不同時間段均可明顯觀察到不同程度的細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），直到所有細胞病變脫落（圖2）。

2.3 細胞工廠大規模培養及工作種子批的制備

按照優化條件分別對比吸附和不吸附條件，各接種10 個細胞工廠后，收獲病毒液檢測每一個細胞工廠血凝效價，結果顯示病毒不吸附接種可以達到和吸附接種相同的血凝效價和感染性滴度。證明大規模培養時可以簡化病毒培養工序而不影響病毒產量。同時，利用該培養系統成功建立了毒種工作種子批，13 mL/支分裝量，一支可接種100 個細胞工廠。結果見表1。

圖1 不同培養條件下血凝效價結果及連續傳代結果

3 討論

本實驗優化了經反向遺傳學重配獲得的H7N9 型流感毒株在Vero 細胞中的培養條件。Vero 細胞生長至對數期時，細胞致密且狀態較好，培養流感病毒后血凝效價最高；而胞齡過大時細胞對流感病毒不敏感，不能引起病毒的有效感染。病毒接種MOI 主要與毒種和病毒感染性滴度有關，若TCID50較低，可能MOI 為0.1 以上才能達到較高的血凝效價[11-12]，而本實驗毒株在MOI 分別為1、0.1、0.01 和0.001 時均可達到相同血凝效價，只是病變時間不同。細胞培養流感病毒時，只有添加TPCK 胰酶使HA0 裂解為HA1 和HA2 后病毒才具有感染性，有研究表明培養流感病毒H5N1 時TPCK 胰酶添加量為5 μg/mL[12]，但是本研究證明過多的TPCK 胰酶會對Vero 細胞造成損傷，導致病毒沒有足夠的宿主細胞來復制，并通過實驗得到TPCK 胰酶添加量應為1.5 μg/mL；TPCK 胰酶隨著病毒復制會被不斷消耗，為了滿足病毒新一輪的復制，培養48 h 后應補加TPCK 胰酶至1.0 μg/mL，此時部分細胞已病變脫落，補加TPCK 胰酶過多會對細胞造成更大損傷。連續傳代15 代后，病毒產量提高，血凝效價可達512，病毒感染性滴度TCID50最高可達108.5/mL，并維持穩定。擴大至細胞工廠培養可行并且對比吸附接種和不吸附接種無顯著性差異，大大簡化了細胞工廠大規模培養工藝，同時證明該毒株可以實現細胞工廠大規模培養，且產量穩定，此外，利用該培養系統建立了工作種子批毒種。

綜上所述，我們確定了用Vero 細胞培養H7N9 流感病毒的條件，獲得高產H7N9 流感病毒的Vero 細胞，并且可以利用該培養系統進行大規模培養生產，成功建立了工作種子批。

圖2 高產毒株的細胞病變效應

表1 不同接種方式的血凝效價和感染性滴度