利用報告基因的人7型腺病毒中和抗體檢測方法的建立

李建華，王步森，吳詩坡，王玉東，趙拯浩，侯利華

軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）屬于腺病毒屬，是一種無包膜的雙鏈DNA 病毒。已報道的HAdV 有90 種，根據血清學及分子學特性，分為A～G 共7 個亞群[1-2]。腺病毒感染可引起多種臨床綜合征，包括呼吸道疾病、結膜炎、膀胱炎、腸胃炎、神經系統疾病等，某些情況下甚至能夠導致死亡[3]。據報道，HAdV 是世界范圍內急性呼吸道疾病的主要原因之一，5%～10%的兒童下呼吸道感染是由其導致的[4]。B 亞群的3、7、14、21、55型和C 亞群的1、2、5、6 型HAdV 是全球范圍內引起急性呼吸系統疾病的主要病原體[5]。據世界衛生組織報告，7 型HAdV（HAdV7）占所有HAdV 感染的近20%，并且引起的疾病也最為嚴重，特別是對于小于7 歲的兒童和免疫缺陷人群[4,6-7]。

HAdV7 也是造成我國腺病毒感染的主要血清型，近年來在我國北京、湖北、廣州、陜西、湖南等地和軍營都有較大規模的HAdV7 疫情暴發，造成了嚴重損失[8-13]。現階段沒有治療HAdV7 感染的有效藥物，美國國防部和梯瓦制藥聯合研發的4 型和7 型口服腺病毒活疫苗在預防腺病毒疫情暴發方面顯示出很好的效果[14]。迄今，我國沒有相關疫苗上市。目前檢測血清中腺病毒中和抗體的方法有兩類：一種是細胞病變法，腺病毒與抗體孵育后，觀察感染細胞產生的細胞病變效應（CPE）或者檢測細胞的活性；另一種則是報告基因法，血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報告基因的表達水平，通過檢測報告基因表達被抑制程度來確定中和抗體水平，常用的報告基因有LacZ、GFP 和螢光素酶基因。傳統的CPE法周期長（4～8 d），觀察比較主觀，靈敏性低，不適于快速準確檢測[15]；而報告基因法可將檢測時間縮短至30 h，方法的重復性好[16]。本實驗中，我們構建了表達螢光素酶的復制缺陷型Ad7-Luc重組病毒，建立了基于該重組病毒的HAdV7 中和抗體檢測方法，檢測了北京地區60 例血清中和抗體水平，初步了解HAdV7 的預存免疫水平。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年3月于解放軍總醫院體檢人群的血清樣本，血清分裝后于-20℃凍存，共60份，其中男性和女性各30份。另外，選取經CPE法驗證的36份HAdV7陽性血清樣本用于報告基因法的建立和驗證。

HEK-293 細胞、A549細胞由本實驗室保存，兩者分別用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素的DMEM和1640培養液，于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養；HAdV7-GZ08（GenBank No.GQ478341）毒株由本室保存；大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞購自全式金生物有限公司；大腸桿菌BJ5183感受態細胞由本室自備；胎牛血清、DMEM和1640培養液、青/鏈霉素、Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit、Tubfect轉染試劑、質粒大提試劑盒均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Gibson Assembly Cloning Kit，限制性內切酶FspⅠ、AsiSⅠ、EcoRⅠ-HF、AatⅡ、BsiW Ⅰ和T4DNA連接酶體系購自NEB公司；2×EXTaqMix、Pyrobest PCR體系、DNA marker、凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和DNA片段回收試劑盒均購自TaKaRa公司；螢火蟲螢光素酶分析試劑和細胞裂解試劑購自Pro?mega公司；XenoLight D-Luciferin Potassium salt購自Perkin Eimer公司；引物合成和測序交由上海生物工程有限公司完成。

1.2 Ad7-Luc重組病毒的制備

首先用Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit 從腺病毒培養液中提取HAdV7-GZ08 的基因組，以其為模板擴增帶有HAdV7 基因組的左右同源臂片段；以pAd4-dE3-luc 質粒（實驗室前期制備）為模板，利用重疊PCR 法構建含卡那霉素抗性基因及pBR322 復制原點的載體區；然后將上述片段用Gibson Assembly Cloning Kit 的方法體外重組，從而獲得同源重組質粒pAd7-re；接下來用FspⅠ內切酶線性化的pAd7-re 片段與HAdV7-GZ08 的基因組通過電轉化在BJ5183 感受態細胞中進行同源重組，從而獲得HAdV7 的空載質粒pAd7-V0；后續用EcoRⅠ-HF 內切酶對質粒E3 區進行部分缺失和再連接獲得pAd7-dE3 質粒；最后用AatⅡ和BsiWⅠ內切酶對E1A 區進行缺失并插入帶有MCMV 啟動子的螢光素酶報告基因表達框，最終獲得重組pAd7-Luc 質粒。相關引物序列見表1。

用AsiSⅠ內切酶將pAd7-Luc 質粒線性化，并用Tubfect 轉染試劑將其導入HEK-293 細胞，培養3～7 d 直至細胞完全病變，并通過連續傳代觀察其穩定性，最終獲得成熟的病毒顆粒，采用蛋白免疫法檢測腺病毒滴度。

表1 引物名稱與序列

1.3 Ad7-Luc重組病毒的體外和體內實驗驗證

為了驗證Ad7-Luc 重組病毒是否構建成功，首先提取相關重組質粒和病毒基因組進行PCR擴增，并將擴增產物測序；其次采用蛋白免疫法檢測獲得的病毒滴度，用不同感染復數（MOI）的病毒感染A549 細胞，檢測24 h 后螢光素酶的表達情況；最后，將經過Source 30Q 純化的重組pAd7-Luc 病毒以1×107IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染BALB/c 小鼠，24 h 后用小動物活體成像儀觀察螢光素酶的表達情況。

1.4 報告基因法檢測抗HAdV7中和抗體的建立與驗證

針對HAdV7 中和抗體的檢測參照5 型腺病毒螢光素酶報告基因檢測方法[16]。將血清于56℃滅活處理1 h，并將其按照首孔1/4 稀釋、后續逐步1/3 稀釋，最終 得 到1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916 共7 個稀釋度的血清；將50 μL 稀釋后的血清轉移至新的96 孔細胞培養板中，每個樣本設置2 個復孔，并設置不加血清和病毒的陰性孔，以及加入50 μL 病毒的陽性孔；每孔加入50 μL 稀釋的Ad7-Luc 重組病毒液，病毒最終含量為2×104IFU/孔，混勻后37℃孵育1 h；將A549 細胞用含2%胎牛血清的DMEM 培養液稀釋至2×105/mL，每孔加入100 μL，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24 h；最后將細胞裂解，用螢光素酶分析檢測試劑盒檢測其表達水平。

中和抗體滴度以陽性對照的螢光素酶表達為參照，將在血清稀釋度中病毒螢光素酶表達抑制達到90%（IC90）時認定為該血清的中和抗體值，用GraphPad Prism 軟件中的四參數非線性回歸進行計算。

為了進一步驗證報告基因法的可靠性，采用傳統的CPE 法進行對比分析，觀察2 種方法的一致性。將滴度為2000 TCID50/mL 的野生型7 型腺病毒與不同稀釋度的陽性血清樣本相互作用1 h，用含2%胎牛血清的1640 培養基將細胞稀釋至2.5×105/mL，每孔加入100 μL，培養至陽性對照孔完全病變后，每孔加入20 μL MTS 溶液，37℃孵育2 h，讀取D490nm值；最后，將CPE 法獲得的中和抗體滴度與報告基因法進行一致性分析。此外，還對不同血清含量的培養基濃度，以及批間、批內檢測結果的一致性進行驗證分析。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析。采用單因素方差分析比較不同條件下測量的中和抗體滴度，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ad7-Luc重組病毒的制備與驗證

已建立的檢測5 型腺病毒中和抗體的螢光素酶報告基因法廣泛應用于流行病學調查和相關5型腺病毒載體疫苗的評價工作[17-18]。基于此方法，本研究中我們通過同源重組，在HAdV7 基因組中缺失E1A 區并插入螢光素酶基因而獲得pAd7-Luc 質粒，具體流程如圖1。所有片段在構建過程中都進行了測序分析（相關引物序列見表1），最終將構建的質粒經過包裝獲得成熟的復制缺陷型Ad7-Luc 重組病毒顆粒，病毒滴度可達4.85×108IFU/mL。

提取pAd7-V0 和pAd7-Luc 質粒，以及HAdV7和Ad7-Luc 重組病毒基因組，進行PCR 擴增，測序結果證明螢光素酶片段的大小、序列及插入位點與預期一致（圖2A）。以不同MOI 的Ad7-Luc 重組病毒感染A549 細胞，檢測到的熒光值不同，MOI 越高則熒光值越高（圖2B）；以MOI=1 感染，24 h 后其熒光值約為8×105。為了進一步驗證Ad7-Luc 重組病毒是否構建成功，將純化的Ad7-Luc 重組病毒以1×107IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染BLB/c 小鼠，24 h 后通過小動物活體成像儀觀察熒光表達情況，Ad7-Luc 重組病毒注射部位可以檢測到明顯的熒光，對照組未檢測到熒光，單位時間和體積內熒光表達強度統計結果具有顯著性差異（Mann-Whitney 檢驗，P=0.0079）（圖2C）。

2.2 基于Ad7-Luc重組病毒中和抗體檢測方法的建立與驗證

檢測不同數量的A549 細胞感染不同稀釋度病毒24 h 后的熒光值，結果如圖3A，MOI 為0.0625～1 時，熒光值與MOI 具有較好的線性關系；MOI＜0.016 時，平行孔間熒光值偏差較大。選擇MOI 為0.016～1 進行后續中和抗體檢測方法學研究。以MOI=0.25、0.50、0.75 和1.00 的病毒劑量，檢測10 份HAdV7 陽性血清的中和抗體值，結果如圖3B，中和抗體檢測結果穩定，4 組間抗體值無統計學差異（One-Way ANOVA 檢驗，n=10，P>0.05）。參考HAdV5 中和抗體檢測病毒滴度，實驗最終選擇MOI=0.75 用于中和抗體檢測。采用傳統CPE 法檢測中和抗體滴度，2 種方法的統計分析顯示了很好的一致性（R=0.8612，P＜0.0001）（圖3C）。此外，為了進一步驗證結果的可靠性，我們還對細胞培養基血清含量的影響進行考察，發現組間沒有明顯差異（圖3D）。為了進一步驗證報告基因法檢測HAdv7 中和抗體的穩定性，我們選擇陽性血清樣本對批間和批內差異進行分析，結果顯示該方法可將批間差異控制在20%以內，批間差異控制在10%以內（圖3E、F），說明方法穩定，重復性好。

2.3 北京地區人群7型腺病毒中和抗體陽性率

基于建立的報告基因檢測方法，我們于2017年3月收集了北京地區共計60 份血清樣本，男女各占50%，分別進行了針對7 型腺病毒和5 型腺病毒中和抗體水平的檢測，將中和抗體滴度按照＜12、12～200、201～1000 和>1000 依次定義為陰性、低滴度、中滴度和高滴度。結果顯示北京地區針對7 型腺病毒的血清陽性率為60%（36/60），明顯低于對應針對5 型腺病毒的血清陽性率75%（45/60），并且該人群7 型腺病毒的中和抗體水平多集中在12～200（低滴度）范圍內，占總人群的45%（圖4A、B）。圖4C 所示該人群中7 型腺病毒中和抗體滴度明顯低于Ad5（Mann-Whitney 檢驗，P=0.0026）；此外進一步對人群中男女性別間中和抗體水平進行統計分析，結果顯示7 型腺病毒的中和抗體水平并不存在性別間的差異（Mann-Whit?ney 檢驗，P=0.5828）（圖4D）。

圖1 Ad7-Luc 重組病毒構建包裝流程圖

圖2 Ad7-Luc 重組病毒的體外和體內實驗驗證

3 討論

自1953年HAdV 首次被發現分離以來，陸續鑒定和分離的HAdV 已有79 種。4 型和7 型腺病毒引起的急性呼吸系統疾病一直是美軍幾十年來重點監測的類型，近年來在美國、中國、意大利、印度、韓國等國家腺病毒引起的呼吸系統疾病檢出率和病例呈上漲趨勢[2-3,14]。HAdV7 作為造成我國腺病毒感染的主要血清型，近年來在我國多地和軍營都有較大規模的暴發[8-13]。

國內針對7 型腺病毒中和抗體的流行病學調查統計報道最早可追溯到20 世紀90年代，趙錦銘等于1995年調查北京、南京、成都和海口的人群腺病毒中和抗體情況，結果顯示HAdV7 總的血清陽性率約22.2%，北京最高（33.5%），海口最低（5.1%）；1999年成都地區人群腺病毒中和抗體調查結果顯示HAdV7 血清陽性率約為15.4%[19-20]。然而自2000年以來，國內并未有新的有關7 型腺病毒中和抗體的調查報告，一個重要的原因就是檢測方法的限制。傳統檢測方法主要依據其引起的細胞病變去判斷，具有主觀性，同時還存在周期長（4～8 d）、穩定性差、靈敏度低等不足之處。而報告基因法中，螢光素酶活性檢測比LacZ和GFP 等報告基因檢測更敏感，操作方法也更為簡便快捷，并且所需靶細胞更少，使其適于大規模樣品的流行病學調查研究[15-16,21]。

我們基于5 型腺病毒中和抗體螢光素酶報告基因法，通過同源重組方法構建復制缺陷型表達螢光素酶報告基因的Ad7-Luc 重組病毒，并對病毒量、細胞數量及培養基血清濃度等因素逐一驗證，獲得了最佳的中和抗體檢測方法。在實驗過程中將該方法與傳統的CPE 檢測方法進行比較，二者顯示了良好的一致性，并且該報告基因檢測方法批間批內實驗展現了很好的穩定性和準確度。此方法的建立將檢測周期縮短至1 d，更加適用于大規模血清樣本的HAdV7 快速檢測，對了解和研究我國HAdV7 的血清流行病學提供了非常重要的方法。

基于該螢光素酶報告基因法，我們收集并完成了北京地區60 份血清樣本的HAdV7 和HAdV5中和抗體檢測，發現HAdV7 血清陽性率為60%，中和抗體滴度多集中在12～200（低滴度）水平。對比1995年和1999年相關報道，我們發現近20年來北京地區7 型腺病毒血清陽性率由33.5%上升到60%，呈大幅度增長趨勢，由此可見7 型腺病毒引起的感染逐漸增加，須引起足夠的重視[22]。此外，本研究中60 份血清樣本針對HAdV5 中和抗體陽性率為75%，抗體滴度大于200 的樣本數占總體的45%，與前期報道（中和抗體陽性率72%，抗體滴度大于200 的樣本數占總體的46.4%）一致[17]。

圖3 Ad7-Luc 重組病毒中和抗體檢測方法的建立和驗證

圖4 北京地區人群7 型腺病毒中和抗體陽性率

研究發現HAdV7 血清陽性率明顯低于C 亞群的HAdV5（72%），顯著高于同亞群的HAdV14（24.8%）和HAdV55（22.4%），其 中HAdV14 和HAdV55 中和抗體滴度分別集中在201～1000（中滴度）和1>1000（高滴度）水平[3]，這一研究結果也進一步證實HAdV7 是B 亞群中更加易感的潛在血清型，其流行病學調查研究具有非常重要的意義。同時，不同性別間中和抗體水平分析表明在不同性別間HAdV7 的感染沒有明顯差異，該結論與HAdV14 和HAdV55 相一致。此外，不同年齡段人群中HAdV7 中和抗體預存免疫水平仍須擴大樣本含量做進一步的統計分析。

HAdV7 作為一種潛在的易感腺病毒血清型，其引起的危害須得到進一步關注和重視，基于螢光素酶報告基因中和抗體檢測方法的建立，對于了解和掌握我國HAdV7 預存免疫水平以及相關腺病毒疫苗的研發評價等工作具有重要意義。