CD31啟動子表達載體的構建與功能鑒定

毛楊柳，常振宇，丁麗華，劉婕，葉棋濃

1.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100850；2.解放軍總醫院 肝膽外二科，北京100853

腫瘤血管系統的形成對于腫瘤的發生、發展以及侵襲轉移有著十分重要的作用[1-3]。血管形成的很大一部分原因是由于血管內皮細胞的生成與增殖，沒有血管內皮細胞生成和增殖，就很難形成腫瘤，也無法轉移[4-5]。傳統觀念認為腫瘤新生血管的內皮細胞是由骨髓來源的內皮祖細胞分化形成的[6-9]，但最近的研究發現腫瘤干細胞也具有向血管內皮細胞分化的能力[10-13]。因此，內皮細胞的發生及鑒定是研究腫瘤細胞發生、分化與轉移的重要手段之一。

目前，鑒定內皮細胞的方法主要是通過內皮細胞的特異性標志物和內皮細胞的功能進行檢測。已知的內皮細胞特異性標志物有CD31、CD105、VEGFR2 等，通過Q-PCR、流式細胞技術、Western 印跡、免疫熒光等技術檢測內皮細胞特異性標志物的表達情況；另外可以通過成管實驗檢測內皮細胞的功能。血小板內皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule- 1，

PECAM-1/CD31）是黏附分子免疫球蛋白超家族成員，可能參與腫瘤細胞黏附于內皮細胞并促進腫瘤血管形成的過程[14]。我們將在內皮細胞中特異性表達的CD31 的啟動子插入融合表達綠色熒光蛋白和螢光素酶的載體，轉染內皮細胞，由此為內皮細胞的鑒定提供新的技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC、BEND3、MCF7細胞，大腸桿菌DH5α，載體pGL4和pCDH-coGFP由本實驗室保存；KpnⅠ與XhoⅠ限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、DNA聚合酶、高保真Pfu酶購自TaKaRa公司；DMEM為本實驗室自配；新生牛血清由浙江天杭生物有限公司生產；高效真核轉染試劑盒Lipo2000購自Invitrogen公司；PCR產物和酶切產物回收試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均為Promega公司產品。

1.2 從基因組釣取CD31啟動子

根據人CD31啟動子序列設計上游引物（5′-GGGGTACCGCCCAGCCGTTAATTCTATTCT-3′）和下游引物（5′-CCGCTCGAGAAGCTTCGATGCTCA TGGAG-3′），并在上、下游引物的5′端分別添加KpnⅠ與XhoⅠ酶切位點，以cDNA為模板進行擴增（反應條件：94℃1min，以94℃ 70 s、65℃40s、70℃ 1 min進行35個循環，72℃ 5 min）。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶位置特異后，膠回收得到CD31 啟動子片段。

1.3 質粒的構建與鑒定

用限制性內切酶KpnⅠ與XhoⅠ將PCR 產物、pGL4 載體和pCDH-coGFP 載體進行酶切，酶切后的產物分別與pGL4 和pCDH-copGFP 載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態并克隆擴大培養，挑取單克隆提取質粒，用KpnⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定并測序。

1.4 質粒瞬時轉染哺乳動物細胞

用含1%雙抗及10%新生牛血清的DMEM 培養基將BEND3、HUVEC、MCF7 細胞分別接種于24孔板中，接種量為轉染時70%～80%最佳，轉染前1h更換新鮮的DMEM培養基。將0.5 μL/孔VigoFect與250μL/孔NaCl 混合，靜置5 min，在此期間將1.5 μg/孔的pGL4-CD31promotor-Lucif?erase 質粒與250 μL/孔的NaCl混合，然后再將2種溶液混勻，室溫靜置15 min 后逐滴加入24 孔板中；以相同方法轉染pGL4.0 載體作為對照。37℃、5% CO2常規培養，4～6 h 后換新鮮的DMEM培養基，24 h 后收取細胞。

1.5 雙螢光素酶檢測

分別將質粒瞬時轉染BEND3、HUVEC、MCF7細胞系，24 h 后棄DMEM，用PBS 清洗2 次后加入1×ULB 裂解細胞，于搖床上裂解30 min。將裂解液同細胞碎片一同吸進EP 管中，振蕩5～10 min，12 000 r/min 離心1 min，取上清做發光檢測。

1.6 慢病毒的包裝

將293T 細胞接種于10 cm 皿中，當細胞密度達到70%～80%時，將慢病毒包裝系統中的pAX2、pLP-VSVG 和pCDH-CD31promotor-copGFP 質 粒 按照一定的比例混合，用無血清無雙抗的DMEM 稀釋，加入一定比例的Megatran 混勻，振蕩10 s，靜置10 min，然后將以上混合液逐滴加入293T 細胞中混勻，48 h 后收集含有病毒粒子的上清液，離心、過濾后置4℃或-80℃保存。

1.7 穩定表達GFP的HUVEC細胞株的構建

將HUVEC 細胞與MCF7 細胞接種于6 cm 皿中，待細胞密度達70%～80%時即可感染，加入包裝好的病毒液，同時加入8 μg/mL 的聚凝胺促進病毒轉染。感染8 h 后更換新鮮培養基，擴大培養后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.8 數據統計

采用SPSS19.0 進行統計學處理分析，所有實驗數據均以x±s表示，3 組間比較采用方差分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒的構建與鑒定

以實驗室保存的基因組DNA 為模板擴增CD31 啟動子序列，即CD31 核酸序列的-710～+116部分，獲得887 bp 片段，與預期一致（圖1）。將載體pGL4 和pCDH-copGFP 用KpnⅠ、XhoⅠ雙 酶切后與PCR 產物連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑選單克隆經菌液PCR 鑒定，或得與目的條帶887 bp 接近的單克隆。陽性克隆經由提取質粒、酶切鑒定，可切出約800 bp 的目的條帶，對照空載體經雙酶切后僅見載體大片段，符合預期結果（圖2）。測序結果表明，插入片段的DNA 序列與CD31 啟動子序列完全一致（圖3）。

圖1 CD31 啟動子的PCR 擴增

圖2 重組質粒pGL4-CD31promoter（A）和pCDH-copGFPCD31promoter（B）的KpnⅠ與XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 pGL4-CD31promoter（A）和pCDH-copGFP-CD31promoter（B）的測序結果

2.2 啟動子活性測定

將構建的pGL4-CD31promotor-Luciferase 質粒和TK 質粒與空載體pGL4.0 和TK 質粒分別瞬時轉染BEND3、HUVEC、MCF7 細胞，24～48 h 后裂解細胞，與特異性底物反應后獲得熒光比值（圖4）。結果表明，與空載體相比，CD31 啟動子特異性在內皮細胞中促進熒光酶表達。CD31 啟動子在乳腺上皮細胞MCF-7 中沒有活性，而在內皮細胞HUVEC 和BEND3 中，CD31 啟動子的活性升高了約7 倍（P＜0.01）。

2.3 GFP穩定表達的MCF7細胞株構建

用包裝好的pCDH-CD31promotor-copGFP 慢病毒分別感染HUVEC 與MCF7 細胞，8 h 后更換培養基，擴大培養后，將被病毒感染過的MCF-7細胞系與被病毒感染過且有熒光的HUVEC 細胞系種于腔室載玻片中，通過免疫熒光可觀察到HUVEC 細胞中有綠色熒光，陰性對照MCF7 細胞中無熒光（圖5），說明CD31 啟動子特異性在內皮細胞中表達。

圖4 pGL4-CD31promotor 啟動子活性

圖5 CD31 啟動子在HUVEC 細胞系與陰性對照MCF-7 細胞系中的表達

3 討論

目前，對于血管內皮細胞的鑒定大部分是通過鑒定其特異性標志物來實現的，由此衍生出許多方法，如Q-PCR、流式分選、Western 印跡、免疫熒光；也有根據內皮細胞的功能進行鑒定，例如成管實驗。但這些方法大部分步驟較為繁瑣，實驗周期較長，且結果往往不具有確定性，須幾種方法結合共同證明內皮細胞的發生。

本實驗通過將內皮細胞標志物CD31 的啟動子構建在帶有GFP 和螢光素酶的表達載體中，將載體轉染目的細胞，通過熒光和螢光素酶的有無來鑒別目的細胞是否具有內皮細胞的特征性標志物，從而起到分選鑒別內皮細胞的作用。利用這種方法可極大地提高實驗效率，只須構建含有內皮細胞標志物啟動子的熒光和螢光素酶表達載體，再轉染目的細胞，即可初步篩選出內皮細胞。此研究為鑒定血管內細胞提供了新的思路。