RBM10通過影響miR-21穩定性參與調控人乳腺癌細胞增殖及轉移活性

劉涵，李天牧，李曉達

1.首都醫科大學 附屬復興醫院腫瘤內科，北京100038；2.民航總醫院 外一科，北京100123

microRNA（miRNA）是一類18～22 個核苷酸的非編碼小RNA，通過與mRNA 完全或不完全互補使靶mRNA 降解或抑制其翻譯，廣泛參與體內眾多生理和病理過程。在已發現的miRNA 中，miR-21 由于在眾多疾病中表達異常而引起醫學界重視。miR-21 在多種惡性腫瘤中表達上調，并通過復雜的調控參與腫瘤的發生、發展[1-4]，這預示miR-21 對癌癥的診斷與治療具有重要研究價值。miR-21 由染色體17q23.2 脆性位點FRA17B上的單基因編碼，含22 個核苷酸，從約3400 個核苷酸的前轉錄本體中分離出來。miR-21 的加工過程與大多數miRNA 一樣，都是經由初始miRNA（pri-miRNA）到miRNA 前體（pre-miRNA），最終被切割形成成熟miRNA。miR-21 基因所在的17q染色體區域的擴增與包括乳腺癌在內的許多腫瘤有關。但在許多miR-21 增高的癌組織中編碼它的基因并沒有擴增[5]，所以癌組織中miR-21 高表達與其基因的擴增并無明確聯系，提示miR-21表達失調可能與轉錄或轉錄后調節有關。換句話說，到目前為止，miR-21 在腫瘤組織中的高豐度存在尚無明確機制。

近年來，RNA 結合基序（RNA binding motif，RBM）受到廣泛關注[6]，其中RBM5 被認為是潛在的肺癌抑制基因[7]，為肺癌的早期診斷、靶向治療及化療耐藥帶來了新希望。因此，更多研究者開始探索RBM 家族其他成員與腫瘤的相關性。而同屬RBM 的RBM10 與RBM5 結構相似[7]，具有高度同源性，昭示其作為潛在抑癌基因的潛力。然而RBM10 到底是抑癌還是促癌，目前存在很大爭議[8-12]。我們以乳腺癌細胞為模型，揭示了RBM10的異常表達以及與miR-21 間的關系，從另一個角度展示了RBM10 在乳腺癌細胞中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231 和永生化的人乳腺正常上皮細胞MCF-10A（中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心）；胎牛血清、DMEM 和DMEM/F12培養基、LipofectAMINE 2000轉染試劑（Invitrogen 公司）；人表皮細胞生長因子、氫化可的松、胰島素（Sigma 公司）；NC-siRNA、RBM10-siRNA（上海吉瑪公司）；All-in-One miR?NAqRT-PCR 檢測試劑盒（GeneCopoeia 公司）；兔抗人RBM10 一抗（Abcam 公司）；兔抗人GAPDH一抗、HRP 標記羊抗兔二抗（中山金橋公司）。

1.2 Oncomine數據庫提取數據

篩選條件如下：①Cancer Type：Breast Can?cer；②Gene：RBM10；③Data Type：mRNA；④Sam?ple Type：Clinical Specimen；⑤Analysis Type：Can?cer vs.Nomial Analysis；⑥臨界值設定條件：Pvalue＜1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%。選擇柱狀圖展示結果。

1.3 miRNA腫瘤組織表達分析

利用starBase 泛癌分析平臺（http://starbase.sy?su.edu.cn/panCancer.php）挖掘來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的不同癌癥類型的mRNA 或miRNA 表達譜。

1.4 細胞培養與細胞轉染

MCF-7 和MDA-MB-231細胞采用DMEM 培養基、MCF-10A 細胞采用DMEM/F12 培養基（添加10%胎牛血清、10 μg/mL 胰島素、500 ng/mL 氫化可的松、20 ng/mL 表皮生長因子、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素），在37℃、含5% CO2孵箱中培養。調整細胞密度，接種無菌6 孔板，每孔約1×106細胞。待其生長至80%融合時，按Lipo?fectAMINE 2000 脂質體轉染試劑盒說明書進行操作，轉染20 nmol/L siRNA 或miRNA 到細胞中，分別作為轉染組（RBM10-si）和陰性對照組（NC）。siRNA 及miRNA 序列包括NC-siRNA（正義鏈）（5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′）、RBM10-siRNA（正義鏈）（5′-ACCGGGACAUGGACUACCG dTdT-3′）、NC mimic（5′-CAGUACUUUUGUGUAG UACAA-3′）、miR-21-5p（5′-UAGCUUAUCAGAC UGAUGUUGA-3′）。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

按照說明書，用TRIzol 提取細胞總RNA。采用2 μg 總RNA 進行反轉錄，qPCR 檢測目的基因及pri-miRNA 的相對含量，GAPDH 為內參。利用All-in-One miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒檢測成熟miRNA 和pre-miRNA 的相對含量，U6 為內參。使用引物序列包括miR-21（正向：5′-TAGCTTAT CAGACTGATGTTGA-3′；反向：5′-GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3′）、RBM10（正向：5′-CTTCGC CTTCGTCGAGTTTAG-3′；反向：5′-GCTTGGGGTC ACTGTAGTGC-3′）、GAPDH（正向：5′-GGTGGTC TCCTCTGACTTCAA-3′；反向：5′-GTTGCTGTAGC CAAATTCGTTGT-3′）、U6（正向：5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′；反 向：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′）。

1.6 細胞中蛋白表達檢測

收集細胞，加人適量RIPA 裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1%去氧膽酸鈉，1 mmol/L EDTA，0.1% SDS，0.2 mmol/L PMSF，1 μg/mL 蛋白酶抑制劑］，于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min 離心20 min，收集上清，用BCA 法測定蛋白質濃度，用12% SDSPAGE 分離蛋白；轉膜至PVDF 膜，用1×TBST 配制5%的脫脂奶粉封閉1 h，按要求稀釋一抗，室溫孵育2 h，1×TBST 洗4 次，每次10 min，室溫孵育山羊抗兔帶HRP 標記的IgG（1∶8000 稀釋），洗膜5 次，每次10 min，用增強發光液在化學發光成像系統中發光顯色。

1.7 細胞遷移實驗

取對數生長期的細胞，制備單細胞懸液，以5×105/孔接種于6 孔板，37℃培養過夜后，進行實驗處理。繼續培養24 h，消化細胞制備單細胞懸液，稀釋為2×105/mL，每種細胞種3 個小室，每個小室中加入200 μL 細胞，在24 孔板中加入500 μL 含10%胎牛血清的培養基作為下液，將Tran?swell 小室放入孔中，繼續培養12～24 h 取出小室；用棉簽擦去小室內表面上未穿膜的細胞，甲醇固定15 min，DAPI 染核10 min，用PBS 洗3 次；于熒光顯微鏡下觀察，不同視野下計數細胞，共計數5個視野，統計結果。

1.8 細胞侵襲實驗

將凍存于-80℃冰箱的Matrigel 于4℃過夜（24 h）使其變成液態。取300 μL 無血清培養基，加入60 μL（或50 μg/每室）Matrigel，4℃混勻，加入Transwell 小室各100 μL（3 個室），在37℃培養箱中孵育4～5 h 至基質膠形成固態，其余步驟同細胞遷移實驗。

1.9 miRNA穩定性實驗

將細胞接種于12 孔板，37℃、5% CO2下培養24 h。用放線菌素D（10 mg/L）處理細胞，分別于0、4、8、12 和24 h 從細胞中分離總RNA，RT-qP?CR 檢測miRNA 的相對豐度。

1.10 統計分析

用SPSS-16.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用x±s表示，組間數據比較采用t檢驗分析和方差分析，多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RBM10和miR-21在乳腺癌組織中的表達水平分析

同時用Oncomine 和starBase 數據庫分析RBM10 在乳腺癌中的表達數據。2 個數據庫的分析結果一致，顯示RBM10 在乳腺癌中的mRNA 相對水平顯著高于癌旁組織或正常對照組織（圖1A、B）。用starBase 數據庫分析miR-21 在乳腺癌中的表達情況，結果顯示miR-21 也在乳腺癌組織中高表達（圖1C），且miR-21 與RBM10 呈共表達正相關趨勢（圖1D）。

2.2 RBM10和miR-21在乳腺癌細胞中的表達水平分析

以人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231 及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A 為細胞模型，用實時定量PCR 檢測RBM10 及miR-21 在不同細胞中的表達差異。結果顯示RBM10 和mIR-21 在2 種乳腺癌細胞中相對于MCF-10A 細胞均呈顯著高表達（圖2），與其在乳腺癌組織中的表達趨勢一致。

圖1 利用數據庫分析RBM10 和miR-21-5p 在乳腺癌組織中的表達

圖2 實時定量PCR 檢測RBM10 和miR-21 在MCF-7、MDA-MB-231 和MCF-10A 細胞中的相對表達（*P＜0.05）

2.3 RBM10參與調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移

在MCF-細胞7 中轉染RBM10 siRNA 后，能夠特異下調RBM10 mRNA 和蛋白表達水平（圖3）。同時，隨著RBM10 表達下調，MCF-7 細胞增殖減慢（圖4A），遷移和侵襲能力也受到抑制（圖4B、C）。但是，如果在利用siRNA 下調RBM10 的同時轉染miR-21，上述對MCF-7 細胞的抑制效應被部分減弱（圖4B、C）。這些結果揭示了RBM10參與調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移，同時發生的調節通路與miR-21 密切相關。

圖3 RBM10 siRNA 對RBM10 的敲低效應

圖4 RBM10 參與調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移

2.4 RBM10在乳腺癌細胞中調控miR-21的穩定性

用RBM10 siRNA 處理MCF-7 細胞后，miR-21 的相對含量隨之下調（圖5A）。進一步檢測發現，miR-21 的初始轉錄本（pri-miR-21）和前體（pre-miR-21）并沒有受RBM10 含量變化的影響（圖5B、C）。用放線菌素D 處理細胞進行RNA 穩定性檢測實驗，結果顯示RBM10 被siRNA 下調后，miR-21 成熟體的穩定性顯著下降（圖5D）。至此，上述實驗結果揭示RBM10 通過調控miR-21 成熟體的穩定性影響miRNA-21 的相對含量。

3 討論

RBM 是新近發現的結構功能相似的RNA 結合蛋白基序家族，是由HUGO 基因命名委員會正式命名的RRB/RBM/RNP 蛋白的亞群。研究顯示RBM 可與RNA 結合，與mRNA 的剪接、翻譯和穩定性有關，尤其在調控凋亡細胞中的重要作用受到廣泛關注。RBM 的主要結構包括被稱為RNA識別基序的RRM、一個共同序列RNA 結合域（CS-RBD）、核糖蛋白域（RNP）和一個RNP 共同序列（RNP-CS）。這些結構有助于RBM 蛋白參與前mRNA 的處 理、mRNA 的拼 接 和mRNA 的穩 定性翻譯。

圖5 RBM10 影響miR-21 的穩定性

隨著研究的進展，RBM 成員越來越多，研究得較多的主要有RBMY、RBM3、RBM5、RBM6、RBM10、RBM12 及RBM15。其 中RBM10 和RBM5都具備D111/G-補片和一個鋅指結構，提示2 種蛋白之間結構的高度重疊性[6]。目前認為RBM5參與多種細胞生物功能，同時也與腫瘤的生長、發展密切相關，被認為是潛在的腫瘤抑癌基因，是一種分布于細胞核，具有識別、結合mRNA 功能的蛋白，可參與機體內mRNA 翻譯、基因表達調控，以及調控細胞增殖和細胞周期，而目前發現它最重要的特征是通過調控凋亡抑制腫瘤細胞的生長[13-15]。對RBM10 的研究相對較少。最初發現RBM10 在部分腫瘤中存在突變，于是將突變與腫瘤相關聯，揭示了RBM10 作為腫瘤抑制因子的相關作用。然而近期越來越多的研究卻表明RBM10 的促癌作用[20-21]。這些截然相反的實驗結果提示我們不僅要深入了解RBM10 表達的下游后果，還要確定負責調節RBM10 本身的機制，對RBM10 的功能研究不能脫離具體環境。

本研究以乳腺癌為模型，通過Oncomine 和starBase 數據庫首先分析了RBM10 和miR-21 在乳腺癌中的高表達，隨后在乳腺癌細胞中證明了它們的共表達相關性，進一步揭示了RBM10 通過調控miR-21 的穩定性影響乳腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力。

RBM10 作為一個RNA 結合蛋白，是否與miR-21 直接相互作用？RBM10 與miR-21 的調控模式在其他腫瘤中是否存在？RBM10 的其他家族成員是否也具有調控miRNA 的能力？這些問題都需要進一步深入研究，以便揭示miRNA 調控網絡的復雜性和RBM 家族的功能多樣性。