嗜水氣單胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF的原核表達及分離純化

劉艷菊，許永斌，王路路，陳金利，蘇曉燕，黃麗菲，桂瑞英，張賀航

大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連116600

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭陰性短桿菌，是一種普遍存在于淡水、污水及土壤中的條件致病菌[1]。嗜水氣單胞菌可分泌多種毒力因子（包括外毒素、胞外蛋白酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號相關(guān)蛋白），可引發(fā)動物的敗血癥、局部皮膚潰爛和內(nèi)臟器官出血等癥狀，同時也可使人類患有急性腸胃炎、膽膜炎和肺炎等疾病[2-3]。目前市售多種抗生素對嗜水氣單胞菌有抑制或殺滅作用，但由于長期濫用導(dǎo)致嗜水氣單胞菌的耐藥性增強，因此，發(fā)現(xiàn)新的抗菌靶點，開發(fā)新的抗菌藥物迫在眉睫[4]。

十一碳焦磷酸合成酶XreF 是嗜水氣單胞菌中一個保守的屬于順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族的胞內(nèi)酶，具有反式結(jié)構(gòu)，催化法尼基焦磷酸的鏈延長，縮合得到十一碳烯基焦磷酸鹽[5-7]。在嗜水氣單胞菌等細菌的多種細胞壁多糖組分生物合成中，十一碳烯基焦磷酸鹽是糖基轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)載體[8-10]。脂多糖是嗜水氣單胞菌中內(nèi)毒素的主要成分，毒性作用主要有熱原性、白細胞數(shù)目減少或增多、彌漫性血管內(nèi)凝血、神經(jīng)癥狀及休克以至死亡等。此外，其中的抗原脂多糖還具有黏附因子的作用，而且一些脂多糖和主要外膜蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物與細胞黏附性和血凝性有關(guān)[11-13]。由于該酶在微生物中高度保守，且在細胞壁的早期合成中具有不可或缺的作用，因此十一碳焦磷酸合成酶失活途徑可作為新型抗菌藥物設(shè)計的靶點[14-15]。根據(jù)相關(guān)文獻報道，十一碳焦磷酸合成酶是功能性同源二聚體，由2 個相對分子質(zhì)量同為29×103的單體組成。目前對嗜水氣單胞菌內(nèi)十一碳焦磷酸合成酶的研究甚少，其具體結(jié)構(gòu)與功能機理不明[16-17]。本實驗旨在原核表達并分離純化嗜水氣單胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF，為進一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和功能機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌由本實驗室保藏；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金公司；Taq酶、T4DNA 連接 酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ購自大連寶生物工程有限公司；pPROEXHTa 載體購自Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 擴增目的基因XreF

根據(jù)已知的XreF基因堿基序列（GenBank：PKD24907.1），用Primer 2.0 軟件設(shè)計上游引物（GGGCCATGGATATGTCGCTTTTGGCAG，下 劃 線處為NcoⅠ酶切位點）和下游引物（GGGCTCGAGTTAGCCGGTCTGTTGCTC，下劃線處為XhoⅠ酶切位點），以嗜水氣單胞菌基因組為模板進行PCR擴增（擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增32 個循環(huán)；72℃延伸5 min）。50 μL 擴增體系包括嗜水氣單胞菌基因組DNA 模板1 μg/mL，上、下游引物各0.8 μmol/L，脫氧核苷酸混合物200 μmol/L，耐熱性DNA 聚合酶0.5 U，1× Ex Taq 擴增緩沖液，加34 μL 超純水補足。4℃保存PCR 產(chǎn)物，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.3 重組表達載體pPROEX-HTa-XreF的建立和陽性克隆鑒定

取XreF基因PCR 回收產(chǎn)物和pPROEX-HTa載體各10 μL，分別用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃反應(yīng)3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收含目的基因及載體的凝膠條帶，向反應(yīng)體系中加入T4DNA 連接酶1 μL，于16℃反應(yīng)過夜，將目的片段與載體連接。用化學轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液涂布于含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，次日從平板上挑取單菌落于3 mL LB 培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取陽性質(zhì)粒測序。

1.4 XreF的原核表達和純化

將測序成功的重組質(zhì)粒pPROEX-HTa-XreF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，形成穩(wěn)定的高表達菌株，挑取菌落劃線培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜；通過液體LB 培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)，使菌液D600nm值達到0.6～1.2，加入終濃度為0.5 mmol/L 的誘導(dǎo)劑IPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。

收集菌體，用緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）懸浮后超聲波破碎（超聲破碎5 min，間隔10 min，超聲5 次），13 000 r/min 離心30 min，棄沉淀；上清液首先經(jīng)金屬鎳離子螯合層析（Ni2+-NTA 柱）初步分離目的蛋白后，用 洗 滌 緩 沖 液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）洗4 次，再用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris- HCl，150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH8.0）洗脫目的蛋白至50 mL EP管中；采用BCA 法定量測定目的蛋白濃度，用15% SDS-PAGE 進行純化鑒定，將初步純化的蛋白用TEV 蛋白酶切除組氨酸標簽，用15% SDSPAGE 鑒定酶切結(jié)果。

用離子交換層析進一步分離純化酶切成功的XreF 蛋白。先用緩沖液B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，2 mmol/L β巰基乙醇，pH8.0）清洗Q 柱，洗去殘留雜蛋白，再用緩沖液A（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巰基乙醇，pH8.0）平衡柱子，然后將用4 倍體積的緩沖液A 稀釋的待純化的蛋白質(zhì)與離子交換柱結(jié)合，用緩沖液B、緩沖液A 的混合液對目的蛋白進行線性洗脫，在280 nm 波長下監(jiān)測洗脫結(jié)果并收集目標樣品。根據(jù)洗脫峰譜圖選擇樣品，用15% SDS-PAGE 檢測分析，回收目的蛋白，濃縮至5 mL 備用。在AKTA 層析系統(tǒng)中用凝膠過濾柱（HiLoad 16/600，Superdex 200pg）進一步純化蛋白，緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巰基乙醇，150 mmol/L NaCl，pH8.0）流速0.5 mL/min，于280 nm波長下監(jiān)測結(jié)果并收集目標樣品。根據(jù)洗脫峰譜圖，選擇樣品用15% SDS-PAGE 檢測分析，回收目的蛋白，濃縮后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 XreF蛋白聚集狀態(tài)檢測

在500 μL 0.8 mg/mL 的XreF 蛋白溶液中加入終濃度為5 mmol/L 的MgCl2溶液，室溫孵育30 min 后注入Superdex75 凝膠過濾層析柱，用AKTA蛋白純化系統(tǒng)設(shè)置0.4 mL/min 流速，以凝膠緩沖液（Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，β巰基乙醇2 mol/L，pH8.0）進行洗脫；對照組蛋白不加MgCl2處理，500 μL 0.1 mg/mL 的XreF 蛋白室溫靜置30 min 后注入Superdex75 凝膠過濾層析柱，以相同條件進行洗脫。洗脫完成后，記錄洗脫峰峰值對應(yīng)的洗脫體積，依據(jù)凝膠過濾柱標準蛋白標準曲線，計算洗脫峰蛋白相對分子質(zhì)量，通過與XreF 蛋白理論相對分子質(zhì)量的對比，確定蛋白聚集狀態(tài)，從而驗證XreF 蛋白聚集狀態(tài)以及鎂離子對XreF 蛋白聚集狀態(tài)的影響。

圖1 XerF 基因片段擴增電泳圖

圖2 pPROEX-Hta-XreF 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2 結(jié)果

2.1 XreF基因的擴增

以嗜水氣單胞菌基因組DNA 為模板PCR 擴增目的基因，大小與XreF目的基因片段大小為774 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出1 條特異性條帶，大小與XreF目的基因（774 bp）一致（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將提取質(zhì)粒后的重組表達載體pPROEXHTa-XreF 用NcoⅠ和XhoⅠ限制酶內(nèi)切酶特異性切割后進行核酸電泳，選取3 個陽性克隆進行雙酶切鑒定，泳道3 樣品顯示了XreF基因條帶和載體條帶（圖2），說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒測序，結(jié)果與XreF基因序列完全一致。

2.3 鎳離子親合層析

將重組質(zhì)粒pPROEX-HTa-XreF 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG 濃度于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，菌體重懸液經(jīng)超聲波破碎后，取上清液進行鎳離子親和層析。初步純化后的蛋白經(jīng)15% SDSPAGE 分析，考馬斯亮藍染色，3 號樣品出現(xiàn)了相對分子質(zhì)量約29×103的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，說明目的蛋白XreF 獲得表達（圖3）。

圖3 XreF 蛋白鎳離子親和層析純化結(jié)果

圖4 XreF 蛋白離子交換層析結(jié)果

圖5 XreF 蛋白凝膠過濾層析純化結(jié)果

2.4 XreF蛋白的純化

2.4.1 離子交換層析純化 將切除組氨酸標簽之后的目的蛋白進行離子交換層析，在洗脫峰中取樣，進行15% SDS-PAGE 檢測分析，結(jié)果見圖4。洗脫峰雖然出現(xiàn)了目的蛋白XreF 的條帶，但仍有部分雜蛋白。因此，收集第一個洗脫峰樣品后，還須通過凝膠過濾層析進一步純化，以提高XreF蛋白的濃度。

2.4.2 凝膠過濾純化 將離子交換層析純化的XreF 蛋白濃縮后進行凝膠過濾層析，在洗脫峰上取樣后用15% SDS-PAGE 檢測，結(jié)果見圖5，獲得的蛋白純度較高。用超濾管將洗脫峰中的蛋白樣品進行濃縮，經(jīng)檢測濃度為17.5 mg/mL。

2.5 XreF蛋白聚集檢測

據(jù)文獻報道，鎂離子能提高XreF 蛋白酶的活性，加快其與底物的結(jié)合[18]。圖6 出峰位置為18.03 mL，依據(jù)標準曲線方程y=10（-0.1306x+3.8213）計算，該洗脫峰對應(yīng)的蛋白相對分子質(zhì)量約29.3×103，與理論值一致，因此洗脫峰對應(yīng)蛋白是XreF蛋白的單聚體。同時對照圖7 可知，鎂離子對XreF 蛋白的聚集狀態(tài)有明顯影響，出峰位置為15.70 mL，對應(yīng)蛋白的相對分子質(zhì)量為59×103，約為單倍體的2 倍。鎂離子是這種蛋白酶發(fā)揮催化活性的的重要配體，我們的研究結(jié)果表明，XreF蛋白很可能在鎂離子的誘導(dǎo)下，由非活性狀態(tài)（單體）向活性狀態(tài)（二聚體）轉(zhuǎn)化。

2.6 XreF結(jié)構(gòu)力分析

目前，已有包括大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌等在內(nèi)的多種微生物的XreF 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)被報道，這些同源蛋白晶體結(jié)構(gòu)均為二聚體，與我們檢測到的嗜水氣單胞菌XreF 具有相同的聚集方式。與嗜水氣單胞菌XreF 序列相似度最高的為大腸桿菌XreF 蛋白，氨基酸序列相似度高達63.6%。大腸桿菌XreF 結(jié)構(gòu)（PDB code：5CQB）中，每個單體延伸出的2 個α螺旋之間的疏水相互作用是二聚體形成的主要作用力。因此，從蛋白同源性角度分析，嗜水氣單胞菌XreF 蛋白很可能以相同的作用力形成二聚體（圖8）。

圖6 未加Mg2+的XreF 蛋白聚集狀態(tài)檢測結(jié)果

圖7 加入Mg2+的XreF 蛋白聚集狀態(tài)檢測結(jié)果

3 討論

近年來，嗜水氣單胞菌引發(fā)的疾病頻繁發(fā)生，給我國淡水漁業(yè)的發(fā)展帶來了很大挑戰(zhàn)，經(jīng)濟損失嚴重，越來越受到公眾的關(guān)注[19]。據(jù)Gen?Bank，嗜水氣單胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF 由258 個氨基酸殘基組成，其編碼基因全長774 bp。XreF 負責十一碳烯基焦磷酸鹽生物合成，是細菌細胞壁生物合成中的必需酶。十一碳焦磷酸合成酶是一類存在于所有生命體中的酶，具有傳遞信息、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的功能[20]。近年來，有關(guān)嗜水氣單胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的同源蛋白研究較多。Kuo 等解析出幽門螺桿菌中十一碳焦磷酸合成酶的晶體結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)抑制劑[20]；Inooshi 等發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌毒素和螺環(huán)己烷對十一碳焦磷酸合成酶活性具有抑制作用，特別是在抗革蘭陽性菌中的耐甲氧西林金黃色葡萄球[7]。但針對嗜水氣單胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的研究較少，仍是一個未充分開發(fā)的新型抗菌藥物的領(lǐng)域。我們本次實驗的目的主要是表達純化嗜水氣單胞菌中的十一碳焦磷酸合成酶，獲得較高純度的目的蛋白，為后續(xù)嗜水氣單胞菌中的XreF蛋白三級結(jié)構(gòu)研究、晶體結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，也為其相關(guān)新型抗菌藥物的研發(fā)提供材料。

圖8 大腸桿菌XreF 蛋白二聚體形成方式