炎癥條件下Ltbp2促進淋巴細胞跨內皮細胞遷移

駢亞亞，聶晶晶，高振祥，胡繼紅

北京醫院 國家老年醫學中心 衛生部臨床檢驗中心，北京100730

淋巴細胞是機體參與正常免疫應答及炎癥反應的重要功能細胞，而高內皮細胞微靜脈（high endothelial venule，HEV）是淋巴細胞向外周淋巴器官運輸的主要通道，由高內皮細胞（high endothelial cells，HEC）、壁細胞及細胞外基質組成[1]。正常情況下，淋巴細胞不斷地從血液經HEV 進入外周淋巴結等免疫組織，周游全身，起免疫監視和免疫保護作用；特別是在炎癥條件下，淋巴細胞能迅速穿過HEC 到達損傷感染部位參與炎癥反應，從而維持機體內環境穩定[2]。研究表明，淋巴細胞的大量浸潤在某些疾病的發生發展過程中起重要作用，明確其機理對于疾病的防治有重要意義。

淋巴細胞與血管內皮細胞之間存在相互對話，即黏附和遷移。所謂黏附，是指淋巴細胞通過自身受體L-selectin、PSDL-1、MadCAM-1、CD44等與血管內皮細胞表面配體PNAd、P-seletin、E-selectin、MadCAM-1 等結合，繼而淋巴細胞被內皮細胞捕獲，并附著于內皮細胞，在內皮細胞上滾動、脫落、活化[3-4]。隨后，淋巴細胞表面的整合素受體或白細胞功能相關抗原1（LFA-1）及晚期抗原4（VLA-4）與血管內皮細胞上高表達的黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 等結合，啟動鈣離子信號通路，繼而引起激動蛋白微絲的收縮，內皮細胞間的緊密連接隨之破壞[4-5]。在趨化因子CCL19、CCL21 的趨化作用下，淋巴細胞跨越血管內皮細胞到達各個組織，行駛其免疫監視和免疫保護功能。

本實驗室前期通過RNA-seq 方法篩選到一些同時在內皮細胞和胸腺門控內皮細胞上高表達的基因，包括組織內轉化生長因子β結合蛋白2（latent-transforming growth factor β-binding pro?tein 2，Ltbp2）基因[6]。Ltbp2 是頭頸鱗癌預后的重要指標之一[7]，也是一種新型診斷標志物[8]，由肺成纖維細胞分泌的Ltbp2 是一種潛在的特發性肺纖維化生物標記[9]，另有文獻報道Ltbp2 能夠促進胃癌細胞的遷移和侵襲[10]。然而，在靜息狀態尤其是炎癥條件下Ltbp2 促進淋巴細胞及其亞群跨內皮細胞遷移的機制至今未見研究報道。因此，探討炎癥條件下Ltbp2 促進淋巴細胞及其亞群跨內皮細胞的遷移，有助于深入理解淋巴細胞跨內皮細胞向外周淋巴結的遷移。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用菌株、細胞、質粒及引物如表1 所示，引物合成及序列測序由Invitrogen 公司完成。DMEM 細胞培養基、胎牛血清、青鏈霉素購自Hy?clone 公司；LipofectAMINE 2000 轉染試劑、嘌呤霉素購自Invitrogen 公司；BsmBⅠ內切酶、DTT 購自Thermo Scientific 公司；mTNFα、CCL19 購自Peprot?ech 公司；流 式抗體購自eBioscience 公司；RNA 提取試劑盒購自全式金生物技術有限公司；TaqDNA 聚合酶、實時定量PCR SYBR Premix Ex Taq、T4DNA 連接酶購自大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素購自Sigma 公司；質粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購自北京天為時代生物科技有限公司；Transwell 小室（5 μm）、細胞培養皿及培養板購自Corning 公司；實時熒光定量PCR 儀ABI 7500 購自美國應用生物系統公司；流式細胞儀BD LSRFortessa 購自美國BD 公司。

表1 本研究所用菌株、細胞、質粒及引物

1.2 敲除載體的構建

利用在線網站（http://crispr.mit.edu）設計1 對sgRNA 引物序列。提取CRISPR/Cas9 敲除質粒pu?ro_Cas9_empty 用BsmBⅠ酶切并膠回收，sgRNA 于16℃退火后用T4DNA 連接酶連接puro_Cas9_emp?ty 和sgRNA，轉化大腸桿菌DH5α，涂氨芐青霉素抗性平板，待長出單菌落后挑取單菌落進行菌落PCR。由于切掉的片段為203 bp，而sgRNA 只有20 bp，因此構建的載體比空載體小180 bp 左右，通過核酸電泳和測序即可獲得正確的敲除載體。

1.3 敲除細胞系的篩選及鑒定

鋪5×104MS1 細胞于6 孔板過夜培養直至細胞密度達到60%左右即可用于轉染。將1～2 μg敲除質粒用LipofectAMINE 2000 轉染，其中不轉染質粒的孔為空白對照，過夜培養后更換為新鮮的DMEM 培養基；用終濃度為2.5 μg/mL 的嘌呤霉素篩選72 h 左右，直至空白對照細胞全部被殺死；胰酶消化剩余細胞，計數并將30～50 個細胞接種至96 孔板，以確保能篩選到單個細胞；單個細胞經1 周培養后，剔除有2 個細胞以上的孔，并轉移至48 孔板擴大培養，然后接著6 孔板培養直至長滿單層細胞；提取基因組并PCR 測序，將正確的敲除細胞系液氮保存。

1.4 淋巴細胞與內皮細胞黏附實驗

鋪1×105內皮細胞于48孔板培養24h，用DMEM培養基洗2次，并加終濃度為10ng/mL的mTNFα刺激過夜；用DMEM培養基洗2次，取C57BL/6野生型小鼠腹股溝和腋窩淋巴結，研磨、計數，按內皮細胞∶淋巴細胞為1∶8的比例進行黏附實驗，時間分別為6和24h；用DMEM培養基洗3～5次，將未黏附的淋巴細胞全部洗掉；胰酶消化后進行流式細胞分析，根據細胞大小區分內皮細胞和淋巴細胞，并統計淋巴細胞占總細胞的百分比。

1.5 內皮細胞表面黏附分子檢測實驗

通過實時定量熒光PCR 和流式細胞術分別從RNA 水平和蛋白水平檢測內皮細胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表達。所用細胞為MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/-MS1，終濃度10 ng/mL 的mTNFα刺激與不刺激，24 h 后提細胞RNA，逆轉錄后分別用ICAM1、VCAM1、P-selectin引物進行RT-PCR，HPRT 為內參。同理，24 h 后用胰酶消化內皮細胞，分別用ICAM1、VCAM1、P-selectin 流式抗體觀察這些黏附分子的蛋白表達水平。

1.6 Transwell實驗

選用5 μm Transwell 小室建立淋巴細胞與內皮細胞的遷移模型。將MS1 細胞和Ltbp2-/-MS1敲除細胞重懸至5×105/mL，并取100 μL 細胞加到Transwell 小室上層，600 μL DMEM 培養基加到小室下層，培養24 h 直至細胞之間形成單層致密緊密連接；DMEM 培養基洗2 次，然后在小室上方加入終濃度為10 ng/mL 的mTNFα刺激過夜，小室下方換成新鮮的DMEM 培養基；DMEM 培養基洗2次，取C57BL/6 野生型小鼠腹股溝和腋窩淋巴結，研磨、計數，按內皮細胞∶淋巴細胞為1∶8 的比例進行遷移實驗，即在小室上方加100 μL 4×106/mL 淋巴細胞，小室下方加600 μL 終濃度為20 ng/mL 的趨化因子CCL19，作用6 h 后收集小室下方淋巴細胞，流式抗體染色并上機分析。

2 結果

2.1 敲除細胞Ltbp2-/-MS1的構建及鑒定結果

我們用CRISPR/Cas9 技術敲除C57BL/6 小鼠胰島內皮細胞MS1 上的Ltbp2基因，最終獲得敲除細胞Ltbp2-/-MS1。首先將MS1 細胞Ltbp2基因第1 個外顯子上的sgRNA 連接到puro_Cas9_empty 空載體上（圖1A），圖譜綠色部分標記sgRNA 插入位點，最后經PCR 和測序鑒定。圖1B 為核酸電泳，由于切掉片段大小為203 bp，而sgRNA 只有20 bp，因此構建的載體比空載體小180 bp 左右，泳道2～4 是構建成功的陽性克隆。測序結果也證明敲除載體構建成功。通過LipofectAMINE 2000 轉染試劑轉染MS1 細胞，其中不轉染質粒的為空白對照，2.5 μg/mL 嘌呤霉素篩選72 h 左右，待未轉染質粒的細胞全部死亡后，分單克隆細胞并逐級擴大培養，提基因組并PCR 測序驗證Ltbp2基因的敲除效率，結果如圖1C 所示，細胞Ltbp2-/-MS1 缺失2 bp，發生移碼突變，證明敲除細胞Ltbp2-/-MS1 構建成功。

2.2 淋巴細胞與內皮細胞黏附結果

在mTNFα刺激下，淋巴細胞黏附MS1 細胞的比例顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，結果如圖2所示。圖2A 是通過流式術區分淋巴細胞和內皮細胞，圖2B、C 分別為淋巴細胞和內皮細胞作用6和24 h 的結果，可見在mTNFα刺激下淋巴細胞與MS1 細胞的黏附顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，且隨著mTNFα濃度升高及時間延長體現出一定的量效關系，并且在mTNFα濃度為10 ng/mL時結合達到飽和。該結果充分證明在炎癥條件下Ltbp2 促進淋巴細胞與內皮細胞的黏附。

圖1 敲除細胞系Ltbp2-/- MS1 的構建及鑒定

2.3 內皮細胞表面黏附分子的表達情況

當淋巴細胞與內皮細胞發生黏附時，內皮細胞會高表達P-seletin、ICAM1、VCAM1 等黏附分子，因此，我們分別從RNA 水平和蛋白水平檢測了MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/-MS1 在mTNFα刺激和不刺激下黏附分子的表達情況，選用mTNFα濃度為10 ng/mL，作用時間24 h，結果如圖3。圖3A 是RNA 結果，圖3B 是流式細胞術檢測結果，縱坐標為幾何平均熒光強度，可見在mTNFα刺激下ICAM1、VCAM1、P-seletin 的表達量均顯著升高，且MS1 細胞表達的ICAM1、VCAM1、P-seletin 顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，證明在炎癥條件下黏附分子ICAM1、VCAM1、P-seletin 參與了內皮細胞和淋巴細胞的黏附過程。

2.4 淋巴細胞跨內皮細胞的遷移結果

用Transwell 方法比較了淋巴細胞及亞群穿過MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/-MS1 的差異。在Transwell 小室上方鋪單層細胞MS1 或Ltbp2-/-MS1，然后用mTNFα刺激，并在小室下方加趨化因子CCL19，最后將淋巴細胞加至小室上方，24 h后流式細胞術分析淋巴細胞及亞群穿過MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/-MS1 的百分比，結果如圖4。統計結果發現淋巴細胞穿過MS1 細胞的比例顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，說明Ltbp2基因缺失嚴重影響了淋巴細胞的跨內皮細胞遷移。我們同時分析了淋巴細胞不同亞群穿過MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/-MS1 的情況，發現CD4、CD8 T 細胞穿過MS1 細胞的比例顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，而B 細胞并無顯著差異，說明CD4、CD8 T 細胞的跨內皮細胞遷移受到Ltbp2基因的影響。

圖2 淋巴細胞與內皮細胞黏附結果比較

圖3 內皮細胞表面黏附分子的檢測

3 討論

淋巴細胞是機體參與正常免疫應答及炎癥反應的重要功能細胞，而內皮細胞是調控淋巴細胞遷入和遷出的重要基質細胞，是通過表達一系列選擇素配體、黏附分子和趨化因子來進行調節的。研究表明，向淋巴結遷入的T細胞高表達L-selectin，而外周淋巴結的高內皮細胞則高表達L-selectin的配體PNAd（peripheral node addressin）。PNAd為一系列能和L-selectin結合的硫化、糖基化和唾液酸化的唾液黏蛋白，包括GlyCAM、CD34、sgp200等。在腸系膜淋巴結及派爾結內的高內皮細胞上，則高表達L-selectin另一配體Mad?CAM-1[11]。P-selectin和E-selectin也參與T細胞的黏附和遷移，其中E-selectin可介導記憶性CD4+T細胞與活化的血管內皮細胞的黏附。此外，T細胞表面的CCR7與HEV介導的趨化因子CCL19或CCL21接觸，使LFA-1發生外翻，隨即與黏附分子ICAM-1、ICAM-2或VCAM-1緊密結合，T細胞被緊緊吸附在HEV上[12]。

淋巴細胞跨內皮細胞遷移主要取決于與高內皮細胞微靜脈的相互作用。我們實驗室前期通過RNA-seq 方法篩選到一些能同時在內皮細胞和胸腺門控內皮細胞上高表達的基因，Ltbp2是其中之一，但Ltbp2是否影響淋巴細胞的跨內皮細胞遷移目前尚無文獻報道。我們用CRISPR/Cas9技術構建了Ltbp2基因的敲除細胞株Ltbp2-/-MS1，PCR 及測序結果證明該敲除細胞株構建成功。由于黏附是淋巴細胞跨內皮細胞遷移的前提，因此我們首先進行了淋巴細胞與內皮細胞的黏附實驗，發現在mTNFα 刺激下，淋巴細胞對MS1 細胞的黏附能力顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，證明基因Ltbp2能促進淋巴細胞與內皮細胞的黏附。我們接著通過RT-PCR 及流式細胞術比較了MS1 細胞和敲除細胞株Ltbp2-/-MS1 表面黏附分子的表達，發現在mTNFα刺激下，MS1 細胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表達量顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，證明黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 參與了內皮細胞和淋巴細胞的黏附過程。最后我們利用Transwell 模型比較了淋巴細胞及其亞群穿過MS1 細胞和敲除細胞株Ltbp2-/-MS1 的差異，發現在mTNFα刺激下，淋巴細胞及其亞群穿過MS1 細胞的能力顯著高于敲除細胞Ltbp2-/-MS1，這一結果提示我們Ltbp2基因可能是淋巴細胞跨內皮細胞遷移的關鍵基因。因此，我們接下來準備研究基因Ltbp2調節淋巴細胞跨內皮細胞遷移的分子機制與功能，比如，Ltbp2可能通過活化酪氨酸磷酸酶SHP2，增強VE-cadherin 的磷酸化水平，導致內皮細胞黏附連接的穩定性降低，從而促進淋巴細胞的跨內皮細胞遷移。我們還可以構建Ltbp2基因敲除小鼠來直接評價Ltbp2對淋巴細胞跨內皮細胞遷移的機制。

圖4 淋巴細胞及其亞群穿過MS1 細胞和敲除細胞Ltbp2-/- MS1 的百分比

目前我們對淋巴細胞跨內皮細胞遷移的認識還太少，因此，本研究不僅可以進一步加深對淋巴細胞遷移和免疫應答機制的理解，同時對淋巴細胞應答的免疫調控和臨床應用也具有一定的指導意義。