腎透明細胞癌中長鏈非編碼RNA SNHG12的生物信息學分析

張曉彤，周亞男，朱玉翠，胡成進，曹源

1.濰坊醫學院 醫學檢驗學系，山東 濰坊261053，2.濟南市第三人民醫院 檢驗科，山東 濟南250132；3.濟南軍區總醫院 實驗診斷科，山東 濟南250031

腎癌是常見癌癥之一，其中腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占70%～80%，是最具代表性的亞型，發病率逐年上升[1-2]。較其他癌癥而言，腎癌相關生物標志物較少，早期診斷困難，且腎癌患者對常規化療和放射治療反應差，缺乏靶向治療藥物，導致晚期患者（Ⅳ期）的五年生存率較低[3]。因此，尋找診斷及伴隨診斷相關生物學標志物、探索發病機制以及找到新的治療靶點至關重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為新的潛在生物學標志物和癌癥治療靶點成為研究熱點。lncRNA是一類長度大于200 個堿基且無蛋白質編碼能力的轉錄物，參與基因表達的多級調節，其異常表達和突變與腫瘤發生、轉移密切相關[4-7]。此外，lncRNA 能在癌癥中特異表達，并穩定存在于循環體液中[8-10]，可作為癌癥的新型生物學標志物和治療靶標，具有很強的應用前景。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因，作為一種新的lncRNA，被證實在肺腺癌、結直腸癌、乳腺癌、人骨肉瘤細胞、鼻咽癌細胞、人子宮內膜癌等多種癌癥類型中上調，在癌細胞增殖和遷移中發揮重要作用[11]。然而，腎透明細胞癌中SNHG12的表達水平及其臨床意義尚不清楚。本研究旨在探討SNHG12在腎透明細胞癌中的表達水平及意義，利用生物信息學方法進行靶基因預測，為后續SNHG12在ccRCC中的機制研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 SNHG12在ccRCC中的表達及生存分析

利用UALCAN 數據庫分析ccRCC 中SNHG12的表達水平，分析其與種族、性別、腫瘤分級之間的關系，并對SNHG12進行生存分析。采用logrank檢驗，運用Kaplan-Meier（KM plotter，http://www.kmplot.com）繪制生存曲線。

1.2 預測與SNHG12相互作用的microRNA

通過RegRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html）預測SNHG12序列上可能存在的mi?croRNA 結合位點。以最小折疊自由能（minimum folding freeenergy，MFE）≤-20、score 值≥150 為標準進 行 預測，score值為lncRNA 與microRNA 配對得分，得分越高表示兩者的結合能力越強。同時，通過HMDD v3.0（http://www.cuilab.cn/hmdd）檢索分析與ccRCC 有關的microRNAs，取此2 種分析結果的交集預測在ccRCC 中可能與SNHG12相互作用的microRNAs。用starBase v3.0 數據庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）探究SNHG12與mi?croRNA 表達水平的相關性。

1.3 預測microRNA靶基因

用starBase v3.0數據庫、Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_61/）及microT-CDS（http://www.microrna.gr/webServer）在線分析平臺預測mi?croRNA 的靶基因。取3個平臺預測交集以避免產生過多假陽性結果，進一步分析其調控網絡。

1.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs相互作用網絡的構建

分別預測SNHG12潛在調控的microRNAs，分析其可能調控的mRNAs，通過Cytoscope 平臺整合SNHG12、microRNAs 和mRNAs 三者信息，構建SN?HG12-microRNAs-mRNAs 網絡調控關系。

1.5 microRNA靶基因的功能分析

靶基因的生物學功能分析利用FunRich（http://www.funrich.org/）平臺進行，Gene Ontology（GO）中的細胞組分（cell component）、分子功能（molec?ular function）和生物過程（biological process）條目以及Pathways 中的KEGG 通路條目被用于分析。

2 結果

2.1 SNHG12在ccRCC中的表達水平及與患者生存時間的關系

利用UALCAN 數據庫分析發現ccRCC 中的SNHG12表達量明顯增高（圖1A，P＜0.001），各腫瘤分級均比正常對照表達增高（圖1B，P值均小于0.001），但分級之間SNHG12的表達水平無差異（圖1B，P值均大于0.05）。SNHG12表達量在男女性別之間有差異，男性患者的表達更高（圖1C，P＜0.001）。此外，不同人種ccRCC 患者間SNHG12的表達無明顯差異（圖1D，P值均大于0.05）。生存曲線結果顯示SNHG12高表達患者的總生存期（overall survival，OS）較低表達患者明顯縮短（圖2，P=0.0049）。

圖1 SNHG12 在ccRCC 中的表達水平

2.2 與SNHG12相互作用的microRNAs

RegRNA2.0 生物學軟件預測顯示，共有273 個microRNAs 能 夠 與SNHG12結 合。HMDD v3.0 數據庫檢索發現18 個與腎腫瘤有關的microRNAs，分別為hsa-mir-106a、hsa-mir-138、hsa-mir-141、hsa-mir-155、hsa-mir-183、hsa-mir-192、hsa-mir-200c、hsa-mir-203、hsa-mir-21、hsa-mir-215、hsamir-23b、hsa-mir-27a、hsa-mir-381、hsa-mir-454、hsa-mir-590、hsa-mir-34a、hsa-mir-362、hsa-mir-497。其 中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p與SNHG12結合的可能性非常大。用starBase v3.0 數據庫探究SNHG12與mi?croRNA 表達水平的相關性，結果顯示SNHG12在ccRCC 中的表達水平與hsa-miR-138-5p、hsamiR-454-3p、hsa-miR-497-5p均呈正相關（r值分別為0.124、0.094、0.085，P值均小于0.05）（圖3）。

2.3 microRNAs-mRNAs調控網絡

通 過targetscan、starBase v3.0 及microT-CDS平臺共同預測這3 個microRNAs 的靶基因，結果顯示可能存在288 個靶基因受這3 個microRNAs調控。其中，hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p和hsa-miR-497-5p的靶基因分別有171、52、65 個。hsa-miR-138-5p的靶基因數量較多，可能參與更為復雜的調控通路。

圖2 SNHG12 的表達與ccRCC 患者的生存關系

圖3 SNHG12 與3 種microRNAs 的相關性分析

2.4 SNHG12-microRNAs-mRNAs調控網絡

結合以上SNHG12-microRNAs與microRNAsmRNAs網絡，最終建立了SNHG12在ccRCC中的SNHG12-microRNAs-mRNAs調控網絡，包括283個節點和291條邊，283個節點代表1個SNHG12、3個microRNAs和279個mRNAs，291條邊表示它們之間存在291種相互作用關系（圖4）。SNHG12位于該網絡中心，調節與之結合的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-497-5p，進而調控下游279個靶基因。其中hsa-miR-138-5p與hsamiR-454-3p共同調節CNOT6L、ZNF275、PLLP、ADCY1、ZEB2，hsa-miR-138-5p與hsa-miR-497-5p共同調節CCND3、PAPPA、MINK1，hsa-miR-454-3p與hsa-miR-497-5p共同調節ZNF609。

2.5 microRNA靶基因的功能分析

為預測SNHG12可能參與的生物過程以及信號通路，將參與SNHG12-microRNAs-mRNAs的3個microRNAs靶基因提交到FunRich平臺，進行GO及KEGG pathway功能分析。GO分析結果顯示，microRNA靶基因在堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝調節過程高度富集（圖5）。KEGG pathway分析顯示，microRNA靶基因高度富集到內皮素（endothelins）、IFN-γ等介導的信號通路。

圖4 SNHG12-microRNAs-mRNAs 網絡調控圖

3 討論

后基因組時代，lncRNA 已經成為闡明癌癥復雜機制的研究重點[12]。lncRNA 參與一系列生物學功能[13]，迄今已有數千種lncRNA 被證實通過與其他分子的相互作用來驅動許多重要的癌癥表型[12,14-15]。帶有microRNA 結合位點的RNA 轉錄物可以作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），特異性競爭microRNA 相互作用并調節彼此的表達水平[16]。ceRNA 調節模式在各種癌癥中被證實[17]，表明腫瘤發生過程中lncRNA和microRNA 之間存在相互作用。癌與對應癌旁組織中具有差異表達的lncRNA、microRNA 和mRNA 可為ccRCC 中潛在生物標志物提供更多的信息。SNHG12是小核仁RNA 宿主基因的成員，位于染色體1p35.3，在子宮內膜癌中被首次報道在癌組織中上調[18]。SNHG12還可通過與HuR 結合，促進神經膠質瘤細胞的增殖和遷移[19]；作為miR-424-5p的內源性分子海綿促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[20]；通過結合miR-195-5p上調Notch2促進骨肉瘤的腫瘤發生和轉移[21]；c-MYC 誘導SNHG12上調促進細胞增殖并抑制三陰性乳腺癌細胞凋亡，并通過調節乳腺癌中MMP13的表達促進細胞遷移[22]；在肝細胞癌中，SNHG12通過與miR-199a/b-5p作用調節MLK3的表達并影響NF-κB 途徑來促進腫瘤發生和轉移[23]。然而，SNHG12在ccRCC 中的表達和功能尚不清楚。

圖5 microRNA 靶基因的GO 聚類分析

本研究以SNHG12為目標基因，利用UALCAN數據庫分析SNHG12在ccRCC 中的差異表達，并對SNHG12進行生存分析。結果表明，ccRCC 組織中SNHG12的表達明顯高于癌旁正常組織，各腫瘤分級均比正常對照表達增高，但SNHG12的表達與腫瘤分級無關，男性患者表達量高于女性患者，表達量具有性別差異，為SNHG12成為ccRCC的生物標志物奠定了基礎。此外，SNHG12高表達ccRCC 患者的總生存期明顯短于低表達患者，表明SNHG12具有作為評估ccRCC 預后的潛力。

通過功能分析和生物信息學預測探討了SN?HG12的調節信息軸。用RegRNA2.0 生物學軟件、HMDD v3.0 及starBase v3.0 數 據庫，發現SNHG12上 存在hsa-miR-138-5p、hsa-miR-454-3p、hsamiR-497-5p這3 種 與ccRCC 相 關microRNAs 的 可能結合位點，從而調節下游的288 個靶基因，構成SNHG12-microRNAs-mRNAs 調控網絡，它們相互作用并調節彼此的表達水平，為研究SNHG12在ccRCC 中的作用機制提供了基礎。microRNA 靶基因在堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝調節過程中高度富集，表明其在生物學過程中發揮作用。KEGG pathway 分析中，microRNA 參與內皮素、IFN-γ等介導的信號通路，這些信號通路均與腫瘤 相 關[24]。von Brandenstein 等[25]報 道，內 皮 素-1可誘導產生NF-κBp65/MAPKp38α/PKCα 轉 錄復合物，PKCα 通過 與pri-miRNA 莖環 結合而阻 止microRNA 成熟，從而對腎細胞癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種腫瘤進行調節。此外，內皮素-1 信號通路可通過EDNRA和EDNRB起作用，并在多發性骨髓瘤中過表達[26]。

本研究闡明了SNHG12具有作為ccRCC 生物標志物的潛力，利用生物信息學方法進行靶基因預測，構建了SNHG12-microRNAs-mRNAs 相互作用網絡，為后續SNHG12在ccRCC 中的機制研究提供了借鑒。但值得注意的是，本研究仍存在一定的局限性。SNHG12的生物學作用尚未通過體內實驗確定，通過生物分析軟件及在線預測軟件對lncRNA 靶標預測可能存在假陽性，該分析結果還需要進一步分析或實驗驗證。