利用CRISPR/Cas9技術構建FHL1基因敲除的HepG2穩定細胞株及其功能鑒定

張亞楠，常振宇，劉婕，丁麗華，葉棋濃

1.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100850；2.解放軍總醫院 肝膽外二科，北京100853

肝癌是常見的消化系統腫瘤之一，其死亡率和發病率都呈逐漸上升的趨勢，已經成為僅次于胃癌和食道癌的第三大常見惡性腫瘤[1]。我國肝癌新發案例占全球的59%，發病率是全球平均發病率的3 倍，確診之后5年生存率僅為10%。

四個半LIM 結構域（four and a half LIM do?mains，FHL）蛋白1（FHL1）屬于FHL 家族，后者是LIM 超家族中只含有LIM 結構域的蛋白家族[2]。LIM 是Lin-11、Isl-1 和Mec-3 這3 種同行域（home?odomain）蛋白質的首字母縮寫。LIM 結構域是富含半胱氨酸的雙鋅指結構[3]，通過介導某些結構蛋白、激酶、轉錄調控因子等多種蛋白質相互作用，對某些基因的表達、細胞分化與發育、細胞骨架形成等發揮重要的調控作用[4]。

成簇的規律間隔的短回文重復序列（clus?tered regularly interspaced short palindromic re?peat，CRISPR）/CRISPR 相關蛋白9 核酸酶（CRIS?PR-associated protein 9，Cas9）是以細菌與古生菌抵御外源病毒入侵獲得性免疫為基礎的基因編輯新技術[5]，經過人工改造后可靈活地對真核細胞進行特異的基因組編輯，具有操作簡單、成本低、效率高和突變位點選擇性強等優點，成為近年來分子生物學領域研究的熱點技術之一[6]。本研究采用CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯技術，在人肝癌細胞系HepG2 中進行FHL1基因的敲除，通過對細胞增殖、遷移能力的檢測，評價CRISPR/Cas9 基因編輯系統在肝癌細胞水平的基因靶向編輯效果，為今后研究FHL1 蛋白在肝癌細胞中的功能提供基因敲除的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T、人肝癌細胞HepG2、大腸桿菌DH5α和CRISPR/Cas9 載體（本實驗室保存）；pPack Packaging Plasmid Mix 病毒包裝載體（SBI公司）；BsmBⅠ限制性內切酶、T4DNA 連接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB 公司）；質粒提取試劑盒（Promega 公司）；膠回收試劑盒、細胞基因組提取試劑盒（康為世紀公司）；DMEM 高糖培養基（Gib?co 公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；抗FHL1的兔多克隆抗體（Proteintech 公司）；辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG、兔抗人GAPDH（Santa Cruz 公司）；小 向 導RNA（small guide RNA，sgRNA）序列合成、鑒定引物合成及質粒測序由北京博邁德基因技術有限公司完成。

1.2 sgRNA的設計

根據CRISPR/Cas9 基因編輯靶點設計原則，利用CRISPR 在線設計網站（http://crispr.mit.edu/），在人FHL1基因的第三外顯子序列設計sgRNA。sgRNA 對應的靶序列長度應為20 bp，靶序列的3′端緊跟NGG 序列，最后選擇網站評分最高的序列。根據設計的sgRNA 序列，在正義鏈模板的5′端添加CACC，反義鏈模板的5′端添加AAAC，使其均能與BsmBⅠ酶切后形成的黏性末端互補。同時根據靶點的位置設計了FHL1敲除效果鑒定引物。引物序列見表1。

1.3 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重組質粒的構建與鑒定

將LentiCRISPR 載體在37℃用BsmBⅠ酶切30 min，膠回收酶切后的載體。將合成的sgRNA引物12 000 r/m 離心后加入適量雙蒸水，使引物的終濃度為100 μmol/L，充分溶解后用T4多聚核苷酸激酶將sgRNA 引物退火成雙鏈（反應體系：上、下游鏈各1 μL，10×T4DNA 連接酶反應緩沖液1 μL，雙蒸水6.5 μL，T4多聚核苷酸激酶0.5 μL；反應條件：37℃ 30 min，95℃ 5 min，然后以5℃/min 的速度降至25℃）。用T4DNA 連接酶將退火后的雙鏈插入酶切后的LentiCRISPR 載體（反應體系：酶切的LentiCRISPR 載體1 μL，退火形成的sgRNA 寡核苷酸雙鏈1 μL，10×T4DNA 連接酶緩沖液1 μL，T4DNA 連接酶緩沖液1 μL，雙蒸水6 μL；室溫連接30 min）。取連接產物轉化100 μL 大腸桿菌DH5α感受態細胞，用含氨芐青霉素的LB 平板篩選，挑取單克隆測序鑒定。

表1 合成寡核苷酸序列

1.4 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA慢病毒的包裝與感染

將293T 細胞接種于6 孔板，以轉染時密度為50%～70%為宜；24 h 后轉染細胞，將1 μg Lenti?CRISPR-FHL1-sgRNA 質 粒 或LentiCRISPR 質 粒 與0.84 μg PLP1、0.4 μg PLP2 及0.56 μg VSVG 加入200 μL 不含血清雙抗的DMEM 中，振蕩混勻，加入10 μL Megatran 1.0 轉染試劑，再次振蕩混勻；室溫靜置10 min，將上述混合物加到種有293T 細胞的6 孔板中，37℃溫箱培養，48 h 后收集上清；取300 μL 病毒上清滴加到準備好的密度約為60%的HepG2 細胞培養基中，24 h 后換液，再次滴加300 μL 病毒上清進行二次感染，培養24 h 后換成帶有嘌呤霉素的DMEM 培養基進行篩選；加藥1 周后，將帶有抗性的單克隆集落用槍頭吸取吹散于24 孔板中，長滿后傳至小皿培養。

1.5 單克隆細胞基因組DNA的提取及鑒定

待小皿中的單克隆細胞長滿后，收取部分細胞，提取基因組DNA，將基因組DNA 作為模板，與設計的鑒定引物構成體系進行PCR 反應，反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，連接pBM23-T 載體，轉化涂板，挑取不同單克隆測序鑒定。

1.6 Western印跡檢測HepG2FHL1基因穩定敲除細胞株

收取部分對照和FHL1敲除的HepG2 細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰浴30 min，加入等體積的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮15 min，進行SDS-PAGE；電泳結束后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，FHL1 抗體 和GAPDH 抗 體室 溫 孵 育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；再用辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG 孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.7 生長曲線實驗

將對照細胞株和FHL1敲除的HepG2 細胞分別消化和計數，接種至96 孔板中，每組實驗設計3 個復孔，每孔細胞約3000 個。在設定好的各個時間點，每孔加入10 μL Cell Counting Kit 8 試劑，37℃靜置1 h，取出后測定樣品的D450nm值。

1.8 細胞劃痕實驗

將對照細胞株和FHL1敲除的HepG2 細胞分別消化，接種至6 孔板中，待細胞長滿后，用無菌移液器槍頭在孔中劃出3 條橫線，棄去培養基，PBS 清洗細胞2 次，去除殘留的細胞，然后加入含0.5%胎牛血清的DMEM 培養基進行培養，于0、24 h 拍照，觀察細胞距劃痕中心的距離。

1.9 統計分析

實驗所有數據采用x±s表示。數據處理運用SPSS 17.0 統計軟件，采用重復測量資料的方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重組質粒的測序鑒定

將構建的重組質粒用U6 引物測序鑒定，結果顯示FHL1sgRNA 成功插入LentiCRISPR 載體，經序列比對，圖1 虛線框內的序列與設計的sgRNA序列完全一致，說明LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重組質粒構建成功。

2.2 Western印跡檢測HepG2FHL1基因敲除細胞株內FHL1蛋白的表達

將LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 包裝的慢病毒感染HepG2 細胞，嘌呤霉素篩選后進行無限稀釋，待單克隆細胞長滿小皿后，挑取4 個細胞克隆，用Western 印跡檢測FHL1 的表達（圖2）。結果顯示，第2 個單克隆細胞中FHL1 蛋白完全沒有表達。分別提取對照細胞和第2 個單克隆細胞的基因組DNA，用設計的鑒定引物進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳后測序鑒定。結果顯示，與對照細胞基因組DNA 相比，FHL1sgRNA 于第三外顯子產生了7 bp 缺失突變，可以改變FHL1基因的開放讀框，從而終止FHL1 蛋白的翻譯（圖3）。結果說明HepG2 細胞FHL1基因敲除穩定細胞株構建成功，將其命名為HepG2-FHL1-KO 細胞。

圖1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重組質粒測序結果

2.3 生長曲線實驗檢測HepG2-FHL1-KO細胞增殖速度的變化

將HepG2-FHL1-KO 細胞和對照細胞接種于96 孔板，用Cell Counting Kit 8 試劑盒檢測敲除FHL1對HepG2 細胞增殖的影響。結果表明，與對照細胞相比，敲除FHL1可以顯著促進HepG2 細胞的增殖（圖4），差異具有統計學意義。

2.4 細胞劃痕實驗檢測HepG2-FHL1-KO細胞遷移能力的變化

通過劃痕實驗比較對照細胞和FHL1敲除的HepG2 細胞的遷移能力，結果顯示，敲除FHL1可以明顯促進HepG2 細胞的遷移（圖5），差異具有統計學意義。

3 討論

肝癌是一種難發現、難診斷、難治療、發展快和預后差的惡性腫瘤，5年生存率只有10%左右，嚴重威脅人類的健康和生命。手術治療、放射治療和藥物治療是目前肝癌治療中的3 種常規方法，但這些治療方式都存在一定的局限性：手術治療不適用于很多中晚期肝癌患者；放射治療對患者正常組織損傷大且容易復發；藥物治療的毒副作用明顯，較其他實體腫瘤更不敏感[7]。肝癌的發生發展是一個多基因、多通路共同參與的過程，近年來隨著高通量測序和生物信息學的快速發展，我們可以很容易地從不同腫瘤細胞中獲取基因組信息，分析比較不同基因在腫瘤細胞中所發揮的不同作用，從而使得針對肝癌的基因治療成為可能。

圖2 Western 印跡檢測單克隆細胞中FHL1 蛋白的表達

圖3 對照細胞（A）和第2 個單克隆細胞（B）基因組DNA 測序結果

RNA 干擾（RNAi）技術，是由雙鏈RNA 介導，引起同源mRNA 高效特異性降解，抑制特異性基因的表達。作為一種高效的序列特異性基因沉默技術，RNAi 在探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域得到廣泛應用[8]。但RNAi技術也存在一定的局限性，如不徹底性、插入染色體位置不確定性和存在脫靶效應等，會在一定程度上影響我們對基因功能的研究。

圖5 劃痕實驗檢測HepG2-FHL1-KO 遷移速度的變化

CRISPR/Cas9 技術是近年出現的一種基因編輯技術，以細菌和古生物菌體內的免疫防御機制為基礎，經過改造，已經成功地在人、小鼠、水稻和斑馬魚等生物上得到廣泛應用[9]。相較于RNAi、鋅指核酸酶（ZFN）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALEN）技術，CRISPR/Cas9 技術具有設計簡單、操作方便、細胞毒性小和基因編輯效率高等特點，迅速成為基因治療領域的一種新手段[10]。

FHL1家族共有FHL1[11]、FHL2[12]、FHL3[13]、FHL4[14]、FHL5/ACT[15]等5 個成員，它們表達分布于不同組織中。FHL1 在該家族中表達最為廣泛，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。研究發現，FHL1 在腦、乳腺、肝、肺、腎、前列腺和皮膚等人組織腫瘤中的表達水平下降；FHL1 通過參與TGFβ信號途徑，調節下游靶基因p21 和c-Myc 的表達，抑制肝癌的發生發展[16]；FHL1 通過與雌激素受體（ER）相互作用，抑制ER 的轉錄活性，從而抑制乳腺癌細胞的生長[17]；FHL1 和Smad4 可以抑制血管內皮生長因子（VEGF）的轉錄活性，從而抑制VEGF 的表達[18]。

本研究采用CRISPR/Cas9 技術構建了Lenti?CRISPR-FHL1-sgRNA 重組質粒，包裝病毒感染HepG2 細胞，經嘌呤霉素篩選得到陽性細胞，Western 印跡檢測FHL1 蛋白的表達，提取細胞基因組DNA 進一步測序鑒定，最終構建了HepG2FHL1基因敲除穩定細胞株，同時用生長曲線實驗和細胞劃痕實驗檢測了細胞增殖和遷移能力的變化。結果表明，FHL1基因敲除的穩定細胞株的增殖和遷移能力均有顯著提升，這與報道的FHL1在肝癌中的抑癌作用一致。綜上，HepG2 細胞FHL1基因敲除穩定細胞株模型的建立，為進一步研究FHL1基因在肝癌發生發展中的作用奠定了基礎。