響應面法優化竹葉黃酮的提取工藝

曹　婧　侯春久　黃志飄

竹葉為禾本科植物竹葉(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥莖葉，性寒，味甘、淡，歸心、胃、小腸經，有清熱除煩、利尿的功效，用于熱病煩渴，小便赤澀淋痛，口舌生瘡等癥[1-3]。竹葉主要含有黃酮、三萜類、多糖、酚性成分、氨基酸、有機酸及多種微量元素，其中黃酮為主要有效成分[4]。本實驗以竹葉總黃酮為對象，采用乙醇水浴浸提的方式，通過響應面分析法對工藝進行優化，對擬合數學模型進行描述，為竹葉總黃酮的進一步開發和利用提供科學依據[5-6]。

1　實驗器材

1.1主要儀器 JY/JP電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；722型紫外/可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；實驗室小型粉碎機，干燥箱（金壇市富華電器有限公司）；旋轉蒸發儀（予華儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司）。

1.2原材料 新鮮竹葉（采自江蘇宜興基地，經烘箱60℃干燥后粉碎未過篩）。

1.3主要試劑 蘆丁標準品（北京譜析科技有限公司）；硝酸鋁；乙醇等試劑為國產分析純，實驗室用水為一次蒸餾水。

2　方法

2.1干燥粉碎 將竹葉洗凈，蒸餾水浸泡24 h，烘箱烘至恒重。將干燥淡竹葉剪碎后，研磨，不過篩，備用。2.2繪制標準曲線 以蘆丁標準品為對照，精密稱取0.01 g蘆丁對照品，用75%乙醇溶解，定容在100 mL的容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的母液，再分別精密量取2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL于100 mL容量瓶中，加2 mL的10%硝酸鋁，充分振蕩5 min，再加75%乙醇補充至刻度，并以75%乙醇為參比液，于510 nm處測定吸光度，繪制蘆丁標準曲線。

2.3竹葉黃酮的提取及測定方法 稱取規定量的竹葉樣品，加入規定體積和濃度的乙醇，在規定溫度下加熱回流提取規定的時間，過濾，收集濾液，濾渣用少量同濃度的乙醇洗滌3次，合并上述濾液，然后在旋轉蒸發儀上蒸干，加75%乙醇溶解并轉移至50 mL的容量瓶中定容，充分搖勻備用。分別從各組單因素實驗得到的樣品溶液中移取1 mL，加2 mL的10%硝酸鋁，再加75%乙醇補充至25 mL，并以75%乙醇為參比液，于510 nm處測定吸光度。

3　結果與分析

3.1標準曲線 根據不同蘆丁濃度對應的吸光度，計算得到曲線方程為：A=17.36C-0.0059，相關系數R2為0.9998。

3.2單因素試驗結果

3.2.1料液比對提取率的影響 按照實驗方法2.3項，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），在60℃下用80%的乙醇水浴浸提4 h，改變料液比。實驗結果見圖1。隨著固液比的增加，總黃酮提取率呈現由低到高，并趨于穩定的趨勢。一方面溶劑的增加可以增大物料與溶劑的接觸面，有利于擴散速度的提高[7]；另一方面，當固液比達到1∶20時，黃酮溶出已趨于穩定，所以繼續增大固液比，提取率變化不大。因此固液比選擇1∶20為宜。

圖1　固液比對提取率的影響

3.2.2提取時間對提取率的影響 按照實驗方法2.3項，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在60℃下用80%的乙醇水浴浸提，改變浸提時間。實驗結果見圖2。竹葉黃酮的提取率先逐漸增大，當提取時間為4 h時達到最高，然后再延長提取時間提取率又開始下降，這說明浸提時間過短，黃酮類物質還未充分溶出，而時間過長，一些熱敏性組分被破壞或部分溶劑揮發導致乙醇濃度降低而使黃酮類化合物提取率降低[7]。

圖2　提取時間對提取率的影響

3.2.3提取溫度對提取率的影響 按照實驗方法2.3項，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在不同溫度下用80%的乙醇水浴浸提4 h，實驗結果見圖3。隨著溫度的升高，提取率隨之增加，并呈緩緩上升趨勢，當溫度達到70℃時提取率最大，溫度超過70℃后提取率略有下降，這是由于隨著溫度的升高，黃酮類物質的擴散速率加快，溶解度也增大，提取率提高，但溫度過高，會造成黃酮類物質容易被破壞而使提取率下降，并且也會使后續操作更為困難。因此提取時溫度選擇70℃為宜。

圖3　提取溫度對提取率的影響

3.2.4乙醇濃度對提取率的影響 按照實驗方法2.3項，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在60℃下用乙醇水浴浸提4 h，改變乙醇溶液的濃度，實驗結果見圖4。隨著乙醇濃度的升高，提取率先變化不明顯，然后在70%～80%范圍內呈明顯上升的趨勢，當乙醇濃度達到80%時，提取率最高，黃酮類物質的溶解度達到最大，之后提取率下降，這可能是由于部分黃酮是水溶性的，隨著乙醇濃度的增大，水的含量變少，這樣水溶性的部分不能充分溶解出來造成的。

圖4　乙醇濃度對提取率的影響

3.3響應面法優化提取竹葉黃酮 選取影響提取過程較大的3個因素：提取時間、提取溫度、乙醇濃度為自變量，應用Design-Expert8.0.6Box-Behnken設計[8-9]優化提取竹葉黃酮的工藝條件。稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固液比1∶20，實驗因素及其水平設計見表1。

表1　自變量及其水平

實驗按隨機化的原則進行，以減少隨機誤差。實驗安排及結果見表2。

表2　實驗安排及結果

3.3.1模型評價 將所得實驗數據進行多元回歸擬合，得到竹葉黃酮提取率Y與乙醇提取各因素變量的二次回歸方程模型為：

Y=0.67+0.017X1+0.008125X2+0.034X3+0.024X1X2-0.055X2X3-0.078 X12-0.07 X22-0.05 X32

對乙醇提取竹葉黃酮的數學模型進行分析，來檢查該方程的有效性。此模型的相關性系數R2為0.9834，線性關系顯著。F值越大，P值越小意味著該項越顯著。從表3可以看出，回歸的模型極其顯著（＜0.0001），同時失擬項不顯著（P=0.2050），一次項中X1、X3的回歸系數顯著，說明提取時間和乙醇濃度對黃酮提取率有顯著影響。交互項X1X2和X2X3的偏回歸系數極顯著，說明提取時間和提取溫度、提取溫度和乙醇濃度的交互項對提取率有顯著影響。說明該方程擬合較好。在所選取的三因素水平范圍內，按照對提取率的影響排序，乙醇濃度對提取率影響最大，提取時間次之，提取溫度影響最小。

表3　回歸系數的顯著性分析

3.3.2響應面分析 3-D曲面是回歸方程的直觀表達形式。考察擬合響應曲面的形狀，分析提取時間、提取溫度和乙醇濃度對黃酮提取率的影響。結果見圖5。由圖5可以看出，兩個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，說明響應值存在極高值。在3個因素的交互作用中，提取溫度的提高，提取時間的增加，都有助于黃酮的充分溶出，而乙醇濃度的增加增大了黃酮的濃度梯度，從而提高了黃酮的溶出速度和得率。

3.3.3最優條件及驗證 利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計對回歸模型進行求解，得到最佳工藝條件。我們將實驗放大10倍，稱取30 g左右的竹葉粉末（未過篩），固液比1∶20，在70℃下用80%乙醇水浴浸提4 h，按照實驗方法2.3項求出黃酮提取率，平行實驗三次。實驗結果為0.6578%，與預測值比較吻合，表明模型是可靠的。

圖5　響應面圖

4　結論

本研究是在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化乙醇提取竹葉黃酮的工藝參數，再建立了回歸方程模型，該模型回歸極顯著，且失擬項不顯著，說明該方程對實驗擬合較好。根據優化提取條件進行驗證實驗，在80%乙醇，提取溫度70℃，提取時間4 h，固液比1∶20的條件下，竹葉黃酮提取率為0.6578%。得到的黃酮具有較高的醫用和食用價值，為竹葉黃酮的進一步研究提供了一定的參考依據。

[1]黃賽金，尹愛武，龔燈，等.淡竹葉多糖的抗衰老作用研究[J].現代食品科技，2015，31(11):51-55.

[2]邵瑩，吳啟南，周婧，等.淡竹葉黃酮對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].中國藥理學通報，2013，29(2):241-247.

[3]付彥君，陳靖.淡竹葉提取物對實驗性高脂血癥大鼠血脂的影響[J].長春中醫藥大學學報，2013，29(6):965-966.

[4]盧偉，楊光義，杜士明，等.竹葉柴胡化學成分和藥理作用研究進展[J].藥學進展，2016，35(2):164-168.

[5]劉康蓮，馮定坤，賀銀菊，等.三都麻竹葉總黃酮的提取及其含量測定[J].食品研究與開發，2015，36(4):62-64.

[6]林娜，尹禮國，董媛媛.硬頭黃竹葉黃酮提取工藝優化[J].江蘇農業科學，2012，40(1):240-241.

[7]姚曦，岳永德，湯鋒.響應面法優化竹葉黃酮萃取工藝及其抗氧化研究[J].食品工業科技，2012，33(21):223-226.

[8]Fan JP，Zhang RF，Zhu JH.Optimization of microwave assisted extraction of total triterpenoid in Diospyros kaki leaves using response surface methodology[J].Asian JChem，2010，22(5):3487-3500.

[9]朱俊訪，李博.響應面法優化淡竹葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝[J].世界中醫藥，2016，11(4):715-717.